Studerer Wnt signale Under fordelingen av Gjennomføre Airways
Summary
Bruken av reporter mus koblet til hele mount og § flekker, mikroskopi og in vivo, letter analyse av mekanismene bak den normale fordelingen av luftveiene. Her beskriver vi hvordan disse teknikkene bidratt til analysen av Wnt signal under tracheal utvikling.
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
I luftrøret utvikling blir initiert ved embryonisk dag 9 (E9) med utseendet av Nkx2.1 positive celler i den ventrale endodermal forutgående 1,2. Esophageal-trakealtuben separasjon vil løse ved E11.5 når rørene kan erklæres som atskilte enheter, hver omgitt av mesenchymale vev tre. Wnt signal spiller en nøkkelrolle i spesifikasjonen i luftveiene som sletting av Wnt2 og Wnt2b, uttrykt av innvoller mesenchyme og sletting av β-catenin fra endodermal respiratorisk epitel vil resultere i lunge agenesis 4,5. Våre tidligere studier fastslått at sletting av WLS, en last reseptor medierende utskillelse av alle Wnt ligander, fra endodermal luftveis resulterer i lunge Hypoplasia, defekter i pulmonal vaskulær utvikling og mis-mønstring av tracheal mesenchyme 6,7. Disse dataene støtter viktigheten av epitel-mesenchymale cross snakke i celledifferensiering og spesifikasjon, som det har også blitt vist i andre studier 8,9.
Studiet av de tidligste stadiene av lunge utvikling er avhengig av genetisk, in vitro og ex vivo teknikker som har tillatt oss å bedre forstå mekanismer som driver luft identitet 10-16. Hele lunge eksplantering kulturer på luften væske inter har vært mye brukt til å studere effekter av vekstfaktorer i tidlige stadier av lunge forgrening morphogenesis 10,17,18. Selv om denne metoden er brukt som avlesning av morfologiske endringer, for eksempel forgrening morphogenesis og genekspresjon modulering, er det begrenset til studiet av tidlige stadier av utviklingsprosessen, som kulturen i seg selv ikke støtter utviklingen av blodkar 17. Utvikling av tracheal brusk krever lengre inkubasjonstid som kan være ikke kompatible med denne kulturen teknikk.
til analyze rolle Wnt signal under luftveiene formasjon, har vi tilpasset standardteknikker for å møte behovene til våre embryonale studier. Vi har endret volum, farging ganger, prosessering sykling for parafin innebygging og timing for clearing av tracheal-lungevevet. Hovedmålet med å optimalisere teknikker beskrevet i denne studien var å analysere de tidligste stadiene av tracheal utvikling hos mus som finner sted fra E11 til E14.5. Bruke reporter mus linjen Axin2LacZ vi nettopp bestemte områder av Wnt / β-catenin aktivitet i utviklings tracheal mesenchyme. Vi har også tilpasset lektin flekker prosedyre for hele mount tracheal vev. Dermed var vi i stand til å visualisere mesenchymale condensations og forutsi områder hvor chondrogenesis vil finne sted. Farging av hele mount og deler av embryonale vev hentet fra WlsShhCre mus, kombinert med avanserte mikroskopi teknikker, tillot oss å avsløre den rollen Wnt ligander produsert av tracheal epitel i tracheal mønster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hendelser som ligger til grunn morfogenese i luftveiene er ikke helt forstått, spesielt de prosesser som er nødvendige for mønstring av de ledende luftveier. Tidligere studier har benyttet ex vivo teknikker, hvor utviklings explants dyrkes på luft-væske interfase eller innebygd i matrigel 21,22. Disse studiene har vist hvordan vekstfaktorer påvirker fordelingen av den tredje luftrøret og dannelse av tracheal brusk. En begrensning til disse studiene er at arkitekturen av vevet ikke er riktig ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner hjelp av Mike Muntifering og Matt Kofron med confocal bildebehandling og Gail Macke med histologiske prosedyrer. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 til DS).
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
