Differentiering af Atrial cardiomyocytter fra pluripotente stamceller Brug af BMP Antagonist Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Protokoller til frembringelse populationer af cardiomyocytter fra pluripotente stamceller er blevet udviklet, men disse giver i almindelighed celler i blandede fænotyper. Forskere interesseret i at forfølge undersøgelser med specifikke myocyt undertyper kræver en mere rettet differentiering tilgang. Ved at behandle mus embryonale stamceller (ES-celler) med Grem2, et udskilt BMP-antagonist, der er nødvendig for atriekammer dannelse in vivo, kan genereres et stort antal hjerteceller med en atrial fænotype. Anvendelse af det konstruerede Myh6-dsRed-Nuc pluripotente stamcelle linje muliggør identifikation, udvælgelse og oprensning af cardiomyocytter. I denne protokol embryoide legemer genereres fra Myh6-dsRed-Nuc celler ved hjælp af den hængende dråbe metoden og holdes i suspension indtil differentiering dag 4 (d4). Ved d4 celler behandles med Grem2 og udpladet på gelatineovertrukne plader. Mellem d8-D10 store ordregivende områder er observeret i de kulturer, og fortsætte med at ekspandere og mstemet gennem d14. Molekylær, histologiske og electrophysiogical analyser indikerer celler i Grem2-behandlede celler erhverver atrial-lignende egenskaber tilvejebringer en in vitro-model til at studere biologi atrielle cardiomyocytter og deres reaktion på forskellige farmakologiske midler.
Introduction
Pluripotente stamceller er et kraftfuldt værktøj til at generere og studere celler fra et væld af svært tilgængelige væv for grundforskning og prækliniske studier, især hos mennesker 1-5. Korrekt modulering af udviklingsmæssige signalveje kan dirigere differentiering af pluripotente stamceller til den ønskede fænotypiske skæbne. Mange protokoller er blevet udviklet til at generere cardiomyocytter (CMS) fra pluripotente stamceller 6-14. Disse protokoller generelt involverer modulering af TFGβ superfamilien (Activin, BMP, og TGFp) og Wnt veje gennem timet tilsætning af exogene vækstfaktorer og / eller små molekyler 10,12-15. Disse protokoller er generelt effektive til at øge procentdelen af celler, der bliver CMS men mangler specificitet, frembringelse af en blandet population af celler, der repræsenterer atrial, ventrikulær og nodal / ledningssystem afstamninger. For at studere specifikke hjertefunktion undertyper en mere rettet differentiering releACH er påkrævet.
Gremlin2 (Grem2, også kaldet Protein Relateret til Dan og Cerberus eller PRDC for korte) er en udskilt BMP-antagonist, der er nødvendig for korrekt hjerte-differentiering og atriekammer dannelse under hjerte-udvikling i zebrafisk 16. Behandling differentierende embryonale stamceller med Grem2 på differentiering dag 4, lige efter peak udtryk for mesodermale markører T-Brachyury og Cerberus ligesom en, øger udbyttet af CMS og genererer en pulje af celler overvejende af atrial afstamning 14.
Rekombinant Grem2 anvendes til behandling af de differentierende celler og kan fremstilles ved anvendelse af standard protein produktionsteknikker 17 eller kan købes kommercielt. Det er meget opløseligt i vandige opløsninger og kan tilsættes eksogent til kulturer på det ønskede tidspunkt.
Differentiering kan spores ved hjælp af RT-qPCR at kvantificere ekspressionen af markører repræsentantaf cardiovaskulære progenitorer, hjerteglykosider progenitorer og engageret CMS. Immunofluorescens kan også anvendes til at identificere og visualisere rumlige fordeling af kardiale celletyper.
Applikationer, der kræver rene populationer er lettere udføres ved brug af et reporter-system til at identificere og isolere CMS. Til dette formål har vi indført αMHC-DsRedNuc konstruere i musen CGR8 ES cellelinje 14. CGR8 celler vokser og forbliver pluripotente uden fødeceller, lette ekspansion og differentieringsfaktorer assays 18. ES-cellelinien indeholder en dsRed fluorescerende protein-kodende sekvens med et kernelokaliseringssignal under hjertets-specifikt a Myosin tung kæde (a Mhc eller Myh6) genpromotor. Ved hjælp af disse celler, kan CM let identificeres og isoleres til kvantificering, cellesortering, elektrofysiologi, lægemiddelscreeninger, og studere mekanismer for atrial differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol rutinemæssigt producerer kulturer med en høj procentdel af CMS, der er karakteristiske for atrial afstamning. Som med enhver differentiering protokol, bør kvaliteten af de mESCs før differentiering være særlig opmærksom. mESCs bør overvåges rutinemæssigt for korrekt morfologi (figur 1A). Enhver spontan differentiering, som finder sted før dannelsen af EB'er vil alvorligt begrænse effektiviteten af cardiogenese og bør fjernes før passage (figur 1B).…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud HL083958 og HL100398 (AKH) og 2T32HL007411-33 "Program i Kardiovaskulære Mekanismer: Træning i Investigation" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
