דיפרנציאציה של פרפור cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים שימוש Grem2 אנטגוניסט BMP
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
פרוטוקולים להפקה אוכלוסיות של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים פותחו, אבל אלה כלליים מניבי תאים של פנוטיפים מעורבים. חוקרים המעוניינים לצאת ללימודים מעורבים תת myocyte ספציפי דורשים גישת בידול מכוונת יותר. על ידי טיפול עכבר גזע עוברי (ES) תאים עם Grem2, אנטגוניסט BMP מופרש כי הוא הכרחי עבור היווצרות תא פרוזדורי in vivo, מספר רב של תאי לב עם פנוטיפ פרוזדורים יכול להיוצר. שימוש הקו התאי גזע Myh6-DsRed-NUC פלוריפוטנטיים המהונדס מאפשר זיהוי, בחירה, וטיהור cardiomyocytes. בפרוטוקול זה גופי embryoid נוצרים מתאי Myh6-DsRed-NUC בשיטת ירידה התלויה ונשמרות השעיה עד יום בידול 4 (D4). בשעת תאי D4 מטופלים עם Grem2 מצופה על צלחות מצופות ג'לטין. בין D8-D10 באזורים וקבלנים גדולים הם נצפו בתרבויות ולהמשיך להתרחב מature דרך D14. מולקולרי, היסטולוגית electrophysiogical מניתוח תאים בתאים שטופלו Grem2 רוכשים תכונות פרוזדורים דמויים מתן מודל במבחנה ללמוד את הביולוגיה של cardiomyocytes פרוזדורי תגובתם סוכנים תרופתיים שונים.
Introduction
תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא כלים רבים עצמה ליצירה ולומד על תאים מפני שורה של קשה לרקמות גישה ללימודי מחקר בסיסיים פרה-קליני, במיוחד אצל בני אדם 1-5. אפנון תקין מסלולי איתות התפתחותי יכול לכוון את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לגורל פנוטיפי הרצוי. פרוטוקולים רבים פותחו כדי ליצור cardiomyocytes (CMS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים 6-14. פרוטוקולים אלה כרוכים אפנון בדרך של TFGβ superfamily (Activin, BMP ו- TGFβ) ו Wnt מסלולי דרך בנוסף מתוזמן של גורמי גדילה אקסוגניים ו / או מולקולות קטנות 10,12-15. פרוטוקולים אלה הם בדרך כלל יעילים להגדיל את אחוז התאים שהופכים CMS, אבל החוסר ספציפי, יצירת אוכלוסייה מעורבת של תאי מייצגי פרוזדורים, חדרית, שושלות מערכת קטרים / הולכה. על מנת ללמוד לב ספציפי לגבי תת-appro בידול מכוון יותרACH נדרש.
Gremlin2 (Grem2, המכונה גם החלבון הקשור לדן סרברוס או PRDC בקיצור) הוא אנטגוניסט BMP מופרש דרוש בידול לב ראוי היווצרות תא פרוזדורים במהלך התפתחות לב דג הזברה 16. טיפול בתאי גזע עובריים הבחנה עם Grem2 ביום בידול 4, רק לאחר ביטוי השיא של סמנים mesodermal T-Brachyury ו סרברוס כמו 1, מגדיל את התשואה של CMS ומייצר מאגר של תאים בעיקר של השושלת פרוזדורים 14.
רקומביננטי Grem2 משמש לטיפול בתאי ההבחנה והוא יכול להתבצע באמצעות טכניקות ייצור חלבון סטנדרטי 17 או ניתן לרכוש מסחרי. זה מאוד מסיס בתמיסות מימיות ניתן להוסיף exogenously לתרבויות בנקודת הזמן הרצוי.
בידול ניתן לעקוב באמצעות RT-qPCR לכמת ביטוי נציג סמניםשל אבות לב וכלי דם, אבות לב, ומחויב CMS. Immunofluorescence יכול לשמש גם כדי לזהות ולדמיין פריסה המרחבית של סוגי תאי לב.
יישומים הדורשים אוכלוסיות טהורות יותר בקלות להתבצע בעת שימוש במערכת כתב לזהות ולבודד CMS. לענין זה, הצגנו את αMHC-DsRedNuc לבנות לתוך הקו הסלולרי העכבר CGR8 ES 14. תאי CGR8 לגדול ולהישאר pluripotent ללא תאים מזינים, הקלת מבחני רחבה והבחנה 18. השורה בתאי הגזע העוברית מכילה רצף קידוד חלבון פלואורסצנטי DsRed עם אות לוקליזציה גרעינית תחת שרשרת לב ספציפי אלפא שרירן הכבד (אלפא MHC או Myh6) אמרגן גן. באמצעות תאים אלה, CMS ניתן לזהות בקלות ומבודד כימות, מיון התא, אלקטרופיזיולוגיה, מסכי סמים, ולומדים מנגנוני התמיינות פרוזדורים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מייצר תרבויות שיגרתיות עם אחוז גבוה של CMS אופייניים שושלת הפרוזדורים. כמו עם כל פרוטוקול בידול, איכות mESCs לפני הבידול יש לתת תשומת לב מיוחדת. mESCs צריכה להיות במעקב שגרתי עבור מורפולוגיה נכונה (איור 1 א). כל התמיינות ספונטנית המתרחשת לפני ההיווצרות ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי HL083958 מענקי NIH ו HL100398 (AKH) ו 2T32HL007411-33 "תכנית ב מנגנוני לב וכלי דם: הכשרת החקירה" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
