Differentiatie van atriale cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen Met behulp van de BMP Antagonist Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Protocollen voor het genereren van populaties van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen zijn ontwikkeld, maar deze leveren in het algemeen cellen gemengd fenotypes. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het nastreven van studies met specifieke myocyten subtypen vereisen een meer gerichte differentiatie aanpak. Door behandeling van muis embryonale stam (ES) cellen met Grem2, een uitgescheiden BMP antagonist die nodig is voor atriale perskamer in vivo is, kan een groot aantal hartcellen een atriale fenotype worden gegenereerd. Het gebruik van de gemanipuleerde Myh6-DsRed-Nuc pluripotente stamcellen lijn zorgt voor identificatie, selectie en zuivering van hartspiercellen. In dit protocol embryo lichamen worden gegenereerd uit Myh6-DsRed-Nuc cellen met behulp van de opknoping neerzetten en in suspensie gehouden tot differentiatie dag 4 (D4). Bij d4 cellen worden behandeld met Grem2 en uitgeplaat op met gelatine beklede platen. Tussen d8-d10 grote aanbestedende gebieden worden waargenomen in de culturen en verder uit te breiden en mtuur door middel van d14. Moleculair, histologische en electrophysiogical duidt cellen in Grem2 behandelde cellen verwerven atriale-achtige kenmerken verschaffen een in vitro model om de biologie van atriale cardiomyocyten en hun reactie op verschillende farmacologische middelen te bestuderen.
Introduction
Pluripotente stamcellen zijn een krachtig hulpmiddel voor het genereren en het bestuderen van cellen van een groot aantal moeilijk bereikbare weefsels voor fundamenteel onderzoek en preklinische studies, vooral bij de mens 1-5. Juiste modulatie van ontwikkelings signaalwegen kan de differentiatie van pluripotente stamcellen direct naar het gewenste fenotypische lot. Veel protocollen ontwikkeld om cardiomyocyten (CM) van pluripotente stamcellen 6-14 genereren. Deze protocollen omvatten in het algemeen modulatie van TFGβ superfamilie (activine, BMP en TGFp) en Wnt paden in getimede additie van exogene groeifactoren en / of kleine moleculen 10,12-15. Deze protocollen zijn in het algemeen effectief in het verhogen van het percentage van cellen die CM geworden, maar missen specificiteit, waardoor een gemengde populatie van cellen die atriale ventriculaire en knooppunten / geleidingssysteem lijnen. Teneinde specifieke cardiale onderzoeken subtypes een gerichte differentiatie voorkomendach vereist.
Gremlin2 (Grem2, ook wel Protein Dan en Cerberus of PRDC kortweg E) is een afgescheiden BMP antagonist die nodig zijn voor een goede cardiale differentiatie en atriale formatie kamer is tijdens de ontwikkeling van het hart in de zebravis 16. Het behandelen van differentiërende embryonale stamcellen met Grem2 op differentiatie dag 4, net na de piek expressie van mesodermale markers T-Brachyury en Cerberus zoals 1, verhoogt de opbrengst van CMS en genereert een pool van cellen voornamelijk uit de atriale lijn 14.
Recombinant Grem2 wordt gebruikt om de differentiërende cellen te behandelen en kan met behulp van standaard eiwit productietechnieken 17 worden gemaakt of kunnen commercieel worden aangeschaft. Het is zeer oplosbaar in waterige oplossingen en kunnen exogeen aan kweken wordt toegevoegd op het gewenste tijdstip.
Differentiatie kan worden gevolgd met behulp van RT-qPCR om de expressie van markers representatief te kwantificerenvan hart- en voorouders, cardiale voorlopercellen, en betrokken CMS. Immunofluorescentie kan ook worden gebruikt voor het identificeren en visualiseren ruimtelijke verdeling van cardiale celtypen.
Toepassingen die pure bevolking nodig zijn gemakkelijker uitgevoerd bij gebruik van een reporter-systeem voor het identificeren en isoleren van CMS. Hiervoor hebben we introduceerde de αMHC-DsRedNuc construct in de muis CGR8 ES-cellijn 14. CGR8 cellen groeien en blijven pluripotent zonder voedingscellen, vergemakkelijken expansie en differentiatie assays 18. De ES-cellijn bevat een DsRed fluorescent eiwit coderende sequentie met een nucleair lokalisatie signaal onder de cardiale-specifieke alfa-myosine zware keten (a Mhc of Myh6) gen promoter. Met behulp van deze cellen, kunnen CM gemakkelijk worden geïdentificeerd en geïsoleerd voor kwantificering celsortering, elektrofysiologie, drug schermen en studie van mechanismen atriale differentiatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol maakt routinematig kweken met een hoog percentage CM die kenmerkend voor de atriale afkomst zijn. Zoals bij elke differentiatie protocol, moet de kwaliteit van de mESCs voorafgaand aan differentiatie bijzondere aandacht worden besteed. mESCs moeten regelmatig gecontroleerd worden op de juiste morfologie (figuur 1A). Spontane differentiatie die plaatsvindt voorafgaand aan vorming van EBS zal sterk de efficiëntie van cardiogenese beperken en moeten worden verwijderd voordat passage (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies HL083958 en HL100398 (AKH) en 2T32HL007411-33 "Program in Cardiovascular Mechanismen: Trainen in Investigation '(JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
