Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
De respons van de individuele cellen op anti-kankergeneesmiddelen belangrijke stap in het bepalen van de populatie respons, en daarom is een belangrijke factor in het algemene resultaat. Immunoblotting, stroomcytometrie en vaste celexperimenten worden vaak gebruikt om te bestuderen hoe cellen reageren op anti-kanker drugs. Deze werkwijzen zijn belangrijk, maar ze hebben een aantal tekortkomingen. Variabiliteit in drug reacties tussen kanker en normale cellen, en tussen cellen van verschillende oorsprong van kanker, en van voorbijgaande aard en zeldzame reacties zijn moeilijk te begrijpen met behulp van de bevolking gemiddelde assays en zonder de mogelijkheid om rechtstreeks te volgen en in lengterichting te analyseren. De microscoop is bijzonder goed geschikt voor het levende cellen. De vooruitgang in de technologie stelt ons in staat om routinematig afbeelding cellen op een resolutie die niet alleen cell tracking, maar ook de waarneming van een verscheidenheid van cellulaire reacties mogelijk maakt. We beschrijven een aanpak in detail die het mogelijk maakt voor de continue time-lapse beeldvorming vancellen tijdens de respons op geneesmiddelen voor wezen zo lang als gewenst, gewoonlijk tot 96 uur. Varianten van de benadering kunnen cellen worden gecontroleerd weken. Met de inzet van genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren talrijke processen, paden en reacties kunnen worden gevolgd. We tonen voorbeelden die volgen en kwantificeren van celgroei en voortgang van de celcyclus, chromosoom dynamiek, DNA schade en celdood omvatten. We bespreken ook variaties van de techniek en de flexibiliteit, en markeer een aantal gemeenschappelijke valkuilen.
Introduction
Levende cellen microscopie en longitudinale volgen van enkele cellen is geen nieuwe techniek. Van de vroegste microscopen, liefhebbers en wetenschappers hebben waargenomen en studeerde enkele cellen en organismen, hun gedrag en de ontwikkeling van 1-3. Een beroemd voorbeeld van de late David Rogers aan de Vanderbilt University in de jaren 1950 toont een menselijke neutrofielen in een bloed uitstrijkje achter een Staphylococcus aureus bacterie en uiteindelijk het proces van fagocytose 4. Deze levende cellen film is een uitstekend voorbeeld van hoe meerdere processen kunnen worden waargenomen en gecorreleerd in een enkel experiment: detectie van een chemische gradiënt, mechanica en snelheid van celmotiliteit, cel vormen dynamiek, hechting en fagocytose van een pathogeen.
De komst van volledig geautomatiseerde microscopen en zeer gevoelige digitale camera's heeft geleid tot een toename van het aantal onderzoekers met behulp van microscopie op fundamentele vragen in de celbiologie, variërend f vragenrom hoe cellen verplaatsen 5,6 en verdeel 7,8 tot dynamiek en membraantransport 9-11 organel. Niet-fluorescerende, helderveld microscopie, met inbegrip van fase-contrast (PC), die de Nobelprijs voor Frits Zernike in 1953 oogstte, en differentieel interferentie contrast (DIC) zorgen voor de waarneming van cellen en kernen, maar ook sub-cellulaire structuren waaronder microtubule bundels , chromosomen, nucleoli, organel dynamiek, en dikke actine vezels 12. Genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten en de ontwikkeling van fluorescerende kleurstoffen tegen organellen dramatisch beïnvloed time-lapse microscopie 13-15. Hoewel niet de focus van dit artikel, beeldvorming in cel sferoïden en in situ (intravitale microscopie) met behulp van confocale microscopie en multi vormen een andere uitbreiding van de aanpak, en er zijn uitstekende artikelen die te gebruiken en te bespreken deze benaderingen 16-19.
De reacties van cellen op anti-Cancer drugs of natuurlijke producten worden bepaald op de moleculaire en cellulaire schaal. Inzicht in cel reacties en lot na behandeling gaat vaak gepaard met de bevolking gemiddeld assays (bijv., Immunoblotting, geheel goed maatregelen), of vaste tijdstippen met immunofluorescentie detectie en flowcytometrie, die enkele cellen te meten. Heterogeniteit in één cel reacties op geneesmiddelen binnen een populatie, in het bijzonder bij tumoren, kan een deel van de variabiliteit verklaren respons gezien in cellijnen en tumoren die worden behandeld met hetzelfde geneesmiddel bij verzadiging. Langdurige longitudinale benaderingen van een bepaalde cel of een populatie van cellen te volgen is een minder voorkomende maar zeer krachtige benadering die het mogelijk maakt de directe studie van moleculaire respons pathways, verschillende fenotypen (bv., Celdood of celdeling), waarneming van cel-tot-cel variabiliteit binnen een populatie, en hoe deze factoren bijdragen aan populatie respons dynamiek 20-22. Optimistisch, in staatom te observeren en te kwantificeren eencellige antwoorden zullen helpen bij het verbeteren ons begrip van hoe geneesmiddelen werken, waarom ze soms niet, en hoe optimaal gebruik te maken hen.
De techniek van lange-termijn time-lapse microscopie longitudinale volgen en analyseren geneesmiddel reacties beschikbaar voor vele onderzoekers en kan eenvoudig zijn met alleen uitgezonden licht fenotype reacties 20,21 observeren. De belangrijkste onderdelen van de aanpak zijn: geschikte voorbehandeling van de cellen van belang, een geautomatiseerde microscoop met omgevingskamer, een camera geïntegreerd met een computer te verwerven en opslaan van de beelden, en software om de time-lapse beoordelen meten en analyseren van de cellen en tl biosensoren. Wij bieden een gedetailleerd protocol met veel tips voor het uitvoeren van time-lapse microscopie van gekweekte cellen voor zo lang als enkele dagen met behulp van helderveld en / of groothoek epifluorescerende microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor elke cellijn kan worden gekweekt in kweekhun reacties op anti-kankertherapieën bestuderen. Wij bieden voorbeelden van data verkregen en geanalyseerd met behulp van meerdere verschillende genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren en een voorbeeld van fase-contrast microscopie, kort ingaan op de verschillende soorten probes, de voor- en nadelen van de lange-termijn time-lapse en longitudinale tracking, wat kan worden geleerd van deze aanpak is dat moeilijk te begrijpen van niet-directe aanpak, en een aantal variaties die we hopen van belang en waarde voor onervaren onderzoekers die niet hebben overwogen met behulp van de aanpak zal zijn, en ervaren onderzoekers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voordelen van de Time-lapse Microscopie en Longitudinal Tracking
De microscoop is een ideaal instrument voor longitudinale studies van geneesmiddelrespons omdat hiermee onderzoekers individuele cellen en hun lot en de gehele populatie te volgen. Variabiliteit in drug antwoord binnen een populatie van cellen is een groot probleem voor anti-kanker therapeutische design. Longitudinaal volgen van enkele cellen kunnen onderzoekers deze variabiliteit observeren en beginnen de onde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
References
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
