Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
Die Reaktion von einzelnen Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente trägt wesentlich die Bevölkerung Antwort bei der Bestimmung, und ist daher ein wichtiger Faktor in dem Gesamtergebnis. Immunoblotting, die Durchflusszytometrie und fixierte Zellexperimente werden oft verwendet, zu untersuchen, wie Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente reagieren. Diese Verfahren sind wichtig, aber sie haben verschiedene Nachteile. Variability in der Arzneimittelreaktionen zwischen Krebszellen und normalen Zellen und zwischen Zellen verschiedener Krebs Ursprungs und transiente und seltene Reaktionen sind schwierig mit Bevölkerung Lungs Assays zu verstehen und ohne direkt in der Lage zu verfolgen und sie in Längsrichtung zu analysieren. Das Mikroskop ist besonders gut geeignet, um Bild lebenden Zellen. Fortschritte in der Technologie ermöglichen es uns, bei einer Auflösung routinemäßig Zellen Bild, das nicht nur Zellverfolgung ermöglicht, sondern auch die Beobachtung einer Vielzahl von zellulären Reaktionen. Wir beschreiben einen Ansatz im Detail, die für die kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es derZellen während der Arzneimittelantwort für im wesentlichen so lange wie gewünscht, in der Regel bis zu 96 Stunden. Mit Variationen des Ansatzes können die Zellen für Wochen überwacht werden. Mit dem Einsatz von genetisch Fluoreszenzbiosensoren codiert zahlreiche Prozesse, Wege und Reaktionen können verfolgt werden. Wir zeigen Beispiele, die Verfolgung und die Quantifizierung von Zellwachstum und die Zellzyklusprogression, Chromosomendynamik, DNA-Schädigung und Zelltod sind. Wir diskutieren auch Variationen der Technik und ihrer Flexibilität und typische Fehler hervorzuheben.
Introduction
Live-Zell-Mikroskopie und Längsverfolgung einzelner Zellen ist keine neue Technik. Von den frühesten Mikroskope haben Enthusiasten und Wissenschaftler beobachteten , und einzelne Zellen und Organismen untersucht, ihr Verhalten und die Entwicklung 1-3. Ein berühmtes Beispiel aus dem späten David Rogers an der Vanderbilt University in den 1950er Jahren zeigt eine menschliche Neutrophilen in einem Blutausstrich ein Bakterium Staphylococcus aureus und schließlich den Prozess der Phagozytose 4 jagen. Diese Live-cell-Film ist ein ausgezeichnetes Beispiel dafür, wie mehrere Prozesse können in einem einzigen Experiment beobachtet und korreliert werden: Erfassen eines chemischen Gradienten, der Mechanik und der Geschwindigkeit der Zellbewegung, Zellformen Dynamik, Adhäsion und Phagozytose eines Pathogens.
Das Aufkommen der vollautomatischen Mikroskope und hochempfindliche Digitalkameras hat sich in einer wachsenden Zahl von Ermittlern führte Mikroskopie grundlegende Fragen in der Zellbiologie bis hin f fragen mitrom , wie Zellen 5,6 und 7,8 dividieren zu Organell Dynamik und Membrantransport 11.09 bewegen. Nicht fluoreszierende, Hellfeldmikroskopie, einschließlich Phasenkontrast (PC), die den Nobelpreis für Frits Zernike 1953 sammelte und Differentialinterferenzkontrast (DIC) für die Beobachtung von Zellen und Zellkerne erlauben, sondern auch subzellulärer Strukturen einschließlich Mikrotubulus-Bundles , Chromosomen, Kernkörperchen, Organell Dynamik und dicke Aktinfasern 12. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine und die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen gegen Organellen haben sich dramatisch Zeitraffer-Mikroskopie 13-15 beeinflusst. Zwar nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, Bildgebung in der Zelle Sphäroiden und in situ (Intravitalmikroskopie) mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen – Mikroskopie stellen eine weitere Ausweitung des Ansatzes, und es gibt hervorragende Artikel , die diese Ansätze 16-19 verwenden und zu diskutieren.
Die Antworten von Zellen auf Anti-cancer Drogen oder natürliche Produkte werden auf der molekularen und zellulären Skala bestimmt. Verständnis Zellantworten und Schicksal nach der Behandlung beinhaltet häufig Population Lungs Assays (z. B. Immunoblotting, ganz gut Maßnahmen) oder festen Zeitpunkten mit Immunofluoreszenz – Nachweis und Durchflusszytometrie, die einzelnen Zellen zu messen. Heterogeneity in Einzelzellreaktionen auf Arzneimittel innerhalb einer Population, insbesondere in Tumoren, können einige der Variabilität in Reaktion auf Zelllinien und Tumoren gesehen erklären, die mit dem gleichen Medikament bei Sättigung behandelt. Langzeitlängs Ansätze einer gegebenen einzelnen Zelle oder einer Population von Zellen zu folgen ist ein seltener , aber sehr leistungsfähigen Ansatz, der für die direkte Untersuchung der molekularen Reaktionswege, verschiedene Phänotypen (z. B. den Zelltod oder die Zellteilung) ermöglicht es , die Beobachtung von Zell-zu-Zell – Variabilität innerhalb einer Population, und wie diese Faktoren tragen zur Bevölkerung Ansprechdynamik 20-22. Optimistisch, in der Lage zu seinzu beobachten und einzelne Zell-Reaktionen zu quantifizieren wird unser Verständnis von zu verbessern, wie Medikamente wirken, warum sie manchmal scheitern, und wie man sie am besten nutzen.
Die Technik der langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie, Längs – Tracking und Analyse von Arzneimittelreaktionen zu vielen Forschern zur Verfügung und kann einfach sein, nur im Durchlicht – Phänotyp Antworten 20,21 zu beobachten. Die Hauptkomponenten des Ansatzes sind: eine angemessene Vorbereitung der Zellen von Interesse, ein automatisiertes Mikroskop mit Klimakammer, eine Kamera mit einem Computer integriert, um die Bilder zu erfassen und zu speichern, und Software, die im Zeitraffer und zu messen und zu analysieren, um die Zellen zu überprüfen und alle Fluoreszenzbiosensoren. Wir bieten ein detailliertes Protokoll mit vielen Tipps für die Durchführung von Zeitraffer-Mikroskopie von kultivierten Zellen so lange wie mehrere Tage mit Hell- und / oder Weitfeld Epifluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll kann für jede Zelllinie verwendet werden, die in Kultur gezüchtet werden können,ihre Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapien zu untersuchen. Wir stellen Beispiele von Daten erfasst und unter Verwendung mehrerer verschiedener genetisch kodierten Fluoreszenz Biosensoren und ein Beispiel für Phasenkontrast-Mikroskopie, kurz verschiedene Arten von Sonden, die Vor- und Nachteile der langfristigen Zeitraffer und Längs Tracking diskutieren, was sein kann für diesen Ansatz gelernt, die aus nicht-direkten Ansätze zu verstehen, und einige Variationen, die wir hoffen, dass sein Interesse und Wert für unerfahrene Forscher, die nicht als mit dem Ansatz, und erfahrene Forscher schwierig ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorteile der Zeitraffermikroskopie und Longitudinal – Tracking
Das Mikroskop ist ein ideales Instrument für Langzeitstudien von Arzneimittelreaktion, wie sie Forscher können einzelne Zellen und ihre Schicksale sowie die gesamte Bevölkerung zu verfolgen. Variability in Ansprechen auf das Medikament innerhalb einer Population von Zellen ist ein wichtiges Thema für Anti-Krebs-Therapie-Design. Längs-Tracking einzelner Zellen ermöglicht Ermittler diese Vari…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
References
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
