Protocol
Etikk Uttalelse: Protokollene for dyr behandling ble godkjent av Vanderbilt Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokoller antall M / 10/117 (svin) og M / 10/219 (mus) og gjennomført i henhold til AAALAC-internasjonale standarder. bruk av banked humane kardiale vev ble godkjent av Vanderbilt University Medical Center IRB (protokollnummer 100887).
1. Prøvetaking og oppbevaring
- Gjøre fersk 4% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB) løsning.
FORSIKTIG: Glutaraldehyd er giftig, bruk hansker og arbeid i en avtrekkshette.- Lag en 0,2 M stamløsning av PB, pH 7,4 ved hjelp av 21,8 g Na 2 HPO 4 og 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum Satis (Qs) til 1000 ml dH 2 O.
- Tilsett 400 ul 50% glutaraldehyd i 2,5 ml PB stamoppløsning og 2,1 ml dH 2 O.
- Fordyp en del (ikke større enn 2 cm 2) av vevet inn i den 4% glutaraldehydløsning. Merknad: Mindre stykker kan også brukes, men bør være av tilstrekkelig størrelse (ikke mindre enn 5 mm 2) for å være lett visualisert med øye for å lette senere trinnene i protokollen.
- Inkuber ved romtemperatur i 1 time, og så legge på ubestemt tid ved 4 ° C.
2. Decellularization of Heart Tissue
- Gjøre fersk 10% vandig NaOH-oppløsning ved bruk av 10 g NaOH-pellets / 100 ml dH 2 O.
FORSIKTIG: NaOH løsninger er etsende og kan forårsake alkali-burns, bruk hansker. - Skyll vev i dH 2 O.
- Inkuber i 10% NaOH-løsning ved romtemperatur i 6 - 10 dager (til vevsforandringer fra rødbrun til off-hvitt eller hvitt).
- Skyll i dH 2 O til vevet blir gjennomsiktig.
- Dyppe vev i 1% garvesyre i 4 timer ved romtemperatur. Bruk en ml 5% stamløsning per 4 ml dH 2 O.
FORSIKTIG: Garvesyreer et sterkt irriterende, bruk hansker. - Skyll i dH 2 O over natten.
3. Osmication og dehydrering av hjertevevet (i avtrekkshette for sikkerhet)
- Foreta en 0,2 M stamløsning av natrium-kakodylat-buffer ved bruk av 21,4 g natrium kakodylat, 10,0 g kalsiumklorid og 450 ml dH 2 O. Blanding, og deretter legge saltsyre etter behov for å justere pH til 7,4. Qs til 500 ml med dH 2 O.
FORSIKTIG: natriumkakodylat og saltsyre er giftige, hansker og arbeid i en avtrekkshette. - Lag 2% vandig stamløsning av osmiumtetroksyd i avtrekkshette for sikkerheten ved oppløsning av 1 g osmiumtetroksyd krystall i 50 ml dH 2 O.
FORSIKTIG: osmiumtetroksyd er en alvorlig risiko ved innånding; dampfiksering av slimhinner eller øynene er mulig, dermed håndtere bare i avtrekksskap med hansker. En sprutbeskyttelse anbefales. - Skyll vev i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer (bland stamløsning på 1: 1 med dH
- Gjenta forrige trinn to ganger, for en total av tre skyllinger buffer.
- Dyppe vev i 1% osmiumtetroksyd i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer (blande lager natriumkakodylat og lager osmiumtetroksyd 1: 1) på rotator i 1 time.
- Skyll vev i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer 3 ganger i 5 min hver på rotator.
- Skyll vev ved bruk av økende konsentrasjoner av etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, og endelig 100%) i 15 min hver på rotator.
4. Tverrsnitt Forbehandling for SEM
- Overfør vev i 100% etanol til et grunt petriskål som inneholdt også 100% etanol.
- Holde to meget skarpe barberblader, slik at flatene på sidene er i kontakt med hverandre, og kuttekanter innlegg for å danne to sider av en likesidet trekant over prøven. For å oppnå dette, bruker venstre hånd til å plassere ett blad på høyre side av prøven ogcut mot venstre. På samme tid, bruker høyre hånd til å plassere det andre bladet helt til venstre av prøven og skive til høyre. Dermed vil knivene skyves mot hverandre fra motsatte retninger for å lage en enkelt glatt kutt.
- Skyv de flate bladsidene mot hverandre for å gjøre et meget rent snitt av prøven med minimal forvrengning eller rivende kraft, fortrinnsvis eksponere et så stort overflateareal som mulig uten å skade prøven.
- Gjenta for hver prøve for å avdekke de reneste mulige tverrsnittsflater for eksamen i SEM.
5. Kritisk Point Tørking (CPD) for Hjerte- Tissue
- Bruke en spatel eller pinsett for å overføre vev til prøveholderen av den kritiske punkt tørker (CPD), slik at vev forblir i 100% etanol til enhver tid. Sørge for at holderen er nedsenket i etanol, og at overføringen oppnås med vevet eksponert mot luft for ikke mer enn noen få sekunder.
- Operere CPD per ossrens veiledning for å fullføre tre purge-and-fill sykluser å erstatte etanol med flytende karbondioksid.
- Operere CPD per brukerveiledning for å oppnå kritisk punkt tørking av prøver og returnere dem til atmosfærisk trykk med kontrollert ventilasjon av CO 2.
6. Montering av Hjerte vevsprøver for SEM
- Fremstille en SEM prøve stuss for hver prøve, ved å feste et karbonklebemiddel fliken til den øvre overflate av aluminium stump.
- Ved hjelp av en stereomikroskop, nøye følge prøven til klisterlappen med tverrsnittet overflaten av interesse vendt opp (vekk fra kategorien, synlig), og så nært som mulig til parallell med planet til prøven spire overflaten. Ikke sondere eller berøre overflaten av interesse.
- Bryt en tre applikator pinne for å oppnå en konisk børste, ideell for påføring av maling. Anvende sølv eller karbon maling på bunnen og sidene av prøven, for å bedre tilslutning til stussen.
- Strekker seg en meget tynn tråd av sølv eller karbon male opp til en kant av den overflate av interesse, for å tilveiebringe en ladebane fra overflaten av interesse til jord.
- Påfør 2 eller 3 små klatter av sølv eller karbon maling rundt omkretsen av fliken karbon, for å tilveiebringe en ledende bane fra karbon fliken overflaten til metallet stussen og dermed til jord.
- Tillat ledende maling tørke i to timer.
- Operere frese belegger per brukerveiledning for å søke en relativt tung belegg (målområdet fra 30 - 40 nm) av gull-palladium legering eller gull. Pumpe prøvekammeret til ca. 0,1 mbar; satt Timer 40 sek. Åpne Set ventilen til 08:00 posisjon (moderat gasstrømmen Argon). Trykk på Start for å starte frese belegg på 30 mA. Purple glød utslippet skal være synlig i prøven kammeret.
7. SEM Undersøkelse av hjerte vevsprøver
- Utføre elektronmikroskopering ved relativt lav akselererende spenning for å minimalisere avbildning problems assosiert med dårlig ladespredning i prøven (lading). Forslag til innledende bildebehandling tilstanden er: 5 kV akselererende spenning, 10 mm arbeidsavstand.
- Med hjelp av en erfaren operatør, ansette økt arbeidsavstand for å utvide dybdeskarpheten i bilde tilstander som krever fokus på fiber i flere knutepunkter fly, eller fiber som strekker seg for betydelig lengde i z dimensjon.
- For mikroskop brukes her (se tabell of Materials), i brukergrensesnittet tilgang fanen Navigation øverst til høyre.
- Åpne fanen koordinater fra Stage menyen. For å øke arbeidsavstand, angir du en større verdi i millimeter for Z koordinere klikk deretter på Gå til fanen for å flytte prøven scenen til angitt arbeidsavstand.
- Ved hjelp av en erfaren operatør, benytter prøve helling og rotasjon å plassere overflaten av interesse vinkelrett på elektronstrålen. Ytterligere vippe av 10-30 degrees fra denne posisjonen kan forbedre observasjon og dokumentasjon av grunnmassestruktur.
- For mikroskop brukes her (se tabell of Materials), i brukergrensesnittet, klikk og hold høyre museknapp, så skyver du til venstre eller høyre for å fokusere prøven nær periferien av preparerte overflaten planet av interesse, bemerker fokusert arbeidsavstanden .
- Naviger med manuell brukergrensesnitt joysticken til å flytte nær den motsatte kanten av overflaten og gjentar fokus. Hvis arbeidsavstand er ikke tilnærmet lik den første posisjon, for å vippe prøven oppnå tilnærmet enighet på begge steder ved hjelp av fanen Koordinater av Stage menyen (se 7.2), og skriv en tilt verdi i T koordinere.
- Roter prøven nitti grader (skriv verdien i R Koordinere feltet) og gjenta prosessen til alle stillingene er fokusert på tilnærmet samme arbeidsavstand.
Merk: Variable trykk SEM kan anvendes for å forbedre ladning ødslinghvis tilgjengelig. Høyvakuum er standard driftsmodus for scanning elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det uthevede teknikken ble brukt til hjerte vev fra en ubrukt menneskelig hjertetransplantasjon donor (figur 1), eksplanterte vev fra resipienter, hjerter fra villtype og dystrofe mus (figur 3), og i post-hjerteinfarkt hjerteprøver fra et svin modell for hjerteskade (figur 2). Som vist i figur 1, er det humane hjerte matriksen en intrikat veven av kryssbundne proteiner som viser en honeycomb-aktig mønster når sett i tverrsnitt. Hver "honeycomb" -strukturen er ca 40 mikrometer brede, vanligvis omgå en enkelt myocyte, når de vurderer planriss i figur 1. Når du er koblet med mellomlag plater, flere cardiomyocytes kan tenkt som en stang kjører langs gjennom "tunnelen" når metaforen er utvidet til tredimensjonalitet. Figur 1 også høydepunkterviktigheten av skjæreprosedyren, med større presisjon som gir mer revelatory topografiske data (Figur 1, øverst til venstre) enn seksjonene som "knuste" under skjæreprosessen (figur 1, øverst til høyre).
Fjerning av fastboende hjerteceller, blodårer, og sirkulasjons celler før SEM behandling avdekker flere ultra-strukturelle detaljer som ville være mindre merkbar ved SEM av hele hjertet vevsblokker. Hver enkelt kollagene "avstiver", for eksempel (figur 1, bunnplatene) er tilsynelatende på linje med jevne mellomrom og vinkelrett på myofibril sarcomeres. Dette arrangement er velegnet for å bidra til å opprettholde hjerte struktur av kontravirkende deformasjoner som utøves under sammentrekning og avslapning sykluser, ligner den "renning og veft 'av tekstiler som bidrar til å opprettholde stoff legemet og formen mot strekking.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 1:. Representative Scanning elektronmikroskopi av Tredimensjonal Arrangement av ekstracellulær matrix i Decellularized venstre ventrikkels Tissue Innhentet fra en ubrukt menneskelig donor hjerte De to øverste panelene viser matrisen i tverrsnitt ved lav forstørrelse (barer = 500 nm), som gir en luftig utsikt over arkitekturen i normal menneskelig hjerte vev. Ved høyere forstørrelse, kan man bedre observere typiske honeycomb-lignende struktur av støttende fibre som gir mekanisk støtte for regelmessig avstand myofibers (midten til venstre og høyre panel barer = 100 nm og 50 nm, henholdsvis). Ved nærmere ettersyn, er hver "honeycomb" sammensatt av fibre som er organisert i parallell med hverandre mens vinkelrett i forhold til hjemmehørende kardiomyocytter (nederst til venstre og på høyre side streker = 10 um og 5 um, henholdsvis).ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I tillegg til å gi strukturell informasjon, kan SEM av decellularized vev tillate meningsfylt, kvalitativ vurdering av ekstracellulære matriks-endringer som respons på skade eller ikke-skadelige former av kardiomyopati. For eksempel ble denne teknikken nylig brukt til å undersøke ekstracellulære matriser av post-infarktsvinehjertevevet 43. I løpet av denne stor-dyreforsøk, spesielt utviklet for å vurdere effekten av den GGF2 isoformen av NRG-1β som en potensiell terapeutisk for hjertesvikt, post-infarkt svin som mottok intravenøs NRG-1β administrering oppviste slående forandringer i hjerte matrisen , sammenlignet med ubehandlede kardiale vev hos post-infarkt dyr. Disse resultatene ble senere publisert 43, og det technique har vært et verdifullt verktøy for å bygge på denne første, serendipitous funn. Figur 2 omfatter eksempel mikrobilder, produsert i løpet av denne studien, som markere drastiske matrix forskjeller mellom ubehandlet og NRG-1β-behandlede matriser.
Figur 2:. Representative Scanning elektronmikroskopi venstre ventrikkel ekstracellulær matriks i Ubehandlede og NRG-1 β behandlede Pigs, etter NaOH Maserasjon Matrisen i tverrsnitt fremhever den vanlige romlige ordning av fiber i ubehandlet etter hjerteinfarkt (post-MI) griser (øverst til venstre), sammenlignet med post-MI NRG-1β-behandlede dyr (øverst til høyre). Sett i lengdegrad, matrisen i ubehandlede svine oppviser en tykk, matte-lignende utseende (nederst til venstre), mens matrisen av NRG-1 p-behandlede griserviser vanlig romlige ordning av fibre (nederst til høyre). Hvit bar = 40 mikrometer (alle fire felt). Mer detaljerte resultater og tallene er med i den tilhørende manuskript 43. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Utforskning av matrise endringene som skjer i dystrofe hjerter har også gitt kvalitative innsikt i progresjon og utvikling av en dyremodell av Duchenne muskeldystrofi kardiomyopati (DMD). I MDX mus, en vanlig brukt musemodell for DMD, det er betydelige og aldersavhengige forskjeller blant villtype og MDX hjerter når så av SEM etter fiksering og NaOH behandling. Som vist i figur 3, matrikskomponenter var forholdsvis vanlig i 6 uker gamle MDX hjerter som mangler funksjonell dystrofin i forhold til normale mus. mer interesting, ekstracellulære matrise organisasjon var tydelig forstyrret eller kanskje degradert i eldre dystrophin-mangelfull mus sammenlignet med yngre MDX mus, som illustrerer den progressive natur DMD i hjertet. Slike dype forskjellene var ikke forventet, fordi MDX mus er dårlig representative for humane DMD kardiomyopati på grunn av det faktum at de oppviser en mye mildere kardiomyopati fenotype og lavere dødelighet enn mennesker med DMD 48. Dette tyder på at selv små endringer i hjertefunksjon kan fanges ved hjelp av visualisering teknikk presentert i dette manuskriptet. Denne metodikken bør også være lett tilpasses de ekstracellulære matriser av andre organer, som det er likeledes ingen tilgjengelige fibrose målretting terapi.
Figur 3: Representative Scanning elektronmikroskopi av Venstre Ventricular ekstracellulær matriks i Wild-type versus MDX Mus. Den venstre ventrikkel hjerte matrise i villtype mus (topplaten) er lik den som er observert hos andre arter. Matrisen i MDX mus ved 6 ukers alder ser relativt normal, men litt "fluffy" i utseende (i midten panel). Omvendt, vises hjerte matrise av eldre mus MDX sterkt degenerert (nedre panel), som indikerer at dystrofiske prosessen kan kvalitativt fanges opp ved hjelp av SEM i faste, NaOH-macerated vev. Hvit bar = 10 mikrometer (alle tre paneler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tverrsnitt forbehandling er den mest kritiske trinn i protokollen. For å bevare fin struktur, må dehydratiserte prøver forbli i 100% etanol til enhver tid til introdusert til det kritiske punktet tørkeprosessen. Derfor kutting av prøvene for å oppnå overflater for EM undersøkelser må gjøres mens prøvene er nedsenket i etanol i et grunt fat. Det er også viktig at den eksponerte overflate ikke berøres eller probet under etterfølgende håndtering. Ingen store endringer er forventet for anvendelse av denne teknikken til andre vevstyper for lignende matrise observasjoner, selv om SEM del av protokollen kan kreve grunnleggende feilsøking elektronmikros uavhengig av prøven opprinnelse. Bilder hentet fra fiberprøvene er utsatt for artefakter innført av dårlig kostnad spredning ( "lading"). Lade problemer kan vanligvis reduseres ved å redusere akselerasjonsspenning, øke skannehastighet (også kalt hviletid) Og reduserer punktstørrelse av elektronstrålen. Integrasjon av flere skanninger samlet raskt nok til å unngå lade gjenstander vil produsere et bilde av tilsvarende signal til støy-kvalitet uten kostnad gjenstander som finnes i en langsommere, høyere kvalitet enkelt skanning bilde.
Denne teknikken er i seg selv kvalitativ og dermed utfyller når de vurderes sammen kvantitative målinger (f.eks Masson s Trichrome eller picoserius rød farging, måling av hydroksyprolin-innhold, massespektrometri og RNASeq) for å finne ut hvordan visualisert strukturelle forskjeller kan være relatert til forskjellige utviklings- eller sykdomstilstander. Men til tross for denne begrensningen, er metoden betydelig utover hjerte fibrose spesielt, fordi den ekstracellulære matrise er en viktig del av nesten alle organer i kroppen. I hjertet, gir den kardiale matrise kritisk mekanisk støtte for kontinuerlig pumping karakterisert ved komplekse strekking, vridning, og deformasjon, som gir optimal oppføring og utstrømming av oksygenrikt og deoxygenated blod 49 for> 2,5 milliarder beats som oppstår over gjennomsnittlig levealderen. Gitt den ekstremt lave evne til reproduksjon av hjertevevet, en dynamisk matrise som kan forandres i henhold til kontekstuelle behov gjør logisk sans. Med bare en liten strekning av fantasi, kan man antyde at det finnes terapeutiske mål for manipulering matrise ombygging for å forbedre helbredelsesprosessen, samtidig som den begrenser negativ fibrose. Bruk av demonstrerte teknikken på et minimum viser raffinement og skjønnhet hjerte matrisen og dermed understreker sin funksjonelle betydning lenger.
Mens verdien av kvantitative mål er en kjerne prinsipp for evaluering av praktisk talt alle eksperimentelle studier, teknikken uthevet her kan benyttes for å avdekke kvalitative ultra varianter som ikke bare utfyller standard matrise målingermen kan foreslå alternative etterforsknings stier å forstå de grunnleggende biokjemiske forandringer som understreker de kvalitative endringer. Forventede fremtidige anvendelser av denne teknikk er dens bruk i hjertesykdomsmodeller og humane vev som et komplementærverktøy for å vurdere endringer matriks, samt utvidet bruk for å studere andre organer hvor det matrise endringer er en del av sykdomsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
- Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
- Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
- Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
- Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
- Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
- Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
- Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
- Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
- Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
- Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
- Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
- Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
- Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
- Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
- Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
- Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias? Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
- Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
- Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
- Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
- Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
- Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural ('small vessel') coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
- Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
- Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
- Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
- Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
- Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
- de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
- Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy--scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
- Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
- Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
- Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
- Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
- Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
- Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
- Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
- Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
- O'Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
- Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
- Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
- Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
- Finsterer, J., Stollberger, C.
- Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773 (2014).
- Caulfield, J. B., Borg, T. K.
- Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
- Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
- Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).
