العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
العضلية مثقف يمكن استخدامها لدراسة cardiomyocyte البيولوجيا باستخدام التقنيات التي هي مكملة للأنظمة في الجسم الحي. على سبيل المثال، ونقاء وسهولة الوصول إليها من ثقافة في المختبر يمكن دفع غرامة السيطرة على التحاليل البيوكيميائية، والتصوير الحي، والكهربية. ثقافة على المدى الطويل العضلية تقدم الوصول إلى المناهج التجريبية الإضافية التي لا يمكن أن تكتمل في الثقافات على المدى القصير. على سبيل المثال، وحتى الآن إلى حد كبير اقتصر التحقيق في المختبر فقد التمايز، دورة الخلية اعادة الدخول، وانقسام الخلايا العضلية على الفئران، والتي تظهر لتكون أكثر قوة في الثقافة على المدى الطويل. ومع ذلك، فإن توافر مجموعة أدوات غنية من خطوط الماوس المعدلة وراثيا ونماذج المرض متطورة تجعل أنظمة الماوس جاذبية للأبحاث القلب. على الرغم من أن العديد من التقارير وجود من الماوس الكبار cardiomyocyte العزلة، عدد قليل من الدراسات تظهر ثقافة على المدى الطويل. المقدمة هنا هي طريقة خطوة بخطوة لالعزلة وطويلة الأجل ثقافة العضلية الماوس الكبار. أولا، يتم استخدام الوراء نضح Langendorff الهضم بكفاءة القلب مع البروتياز، تليها تنقية خطورة الترسيب. بعد فترة من العزلة فقد التمايز التالية، وخلايا إرفاق تدريجيا للثقافة ويمكن تربيتها لمدة أسابيع. يستخدم المحللة خلية اتش لتنبيغ بكفاءة العضلية معزولة. وتوفر هذه الأساليب لذلك، نظام نموذجي بسيطة لكنها قوية لدراسة البيولوجيا القلب.
Introduction
وكثيرا ما تستخدم العضلية مثقف لمراقبة سلوك الخلايا في بيئة تسيطر عليها بشكل جيد في المختبر. على سبيل المثال، خصائص الخلية المورفولوجية والكهربائية، والكيمياء الحيوية، أو الميكانيكية يمكن دراستها على ركائز هندسيا، 1،2 في وسائل الاعلام محددة، وردا على المخدرات جزيء صغير، والببتيدات، تنظيم الجينات، 3 أو التحفيز الكهربائي. 4 المحتوى الخلوي يمكن أيضا يمكن السيطرة عليها باستخدام تعريف المشترك الثقافات. 5 هذه التجارب في المختبر هي مفيدة في مجال مكافحة المخدرات كبيرة أو شاشات الوراثية وتكمل في طرق الحي لأنواع مختلفة من التحقيقات التي تنطوي على البيولوجيا cardiomyocyte.
ثقافة على المدى الطويل تمكن السبل التجريبية التي تتطلب فترات زمنية طويلة لتحقيق التغيير المظهري. والمثال في الوقت المناسب هو أن من البالغين انتشار cardiomyocyte الثدييات، حيث عادة ما يتم دراستها فقد التمايز، دورة الخلية اعادة الدخول، وانقسام الخلايا على ذاتهأيام veral إلى أسابيع. 6،7 هنا، وهي المرة ثقافة بمد يسهل التلاعب الجيني، 7،8 فقد التمايز الوظيفي (على سبيل المثال، التفكيك الساركومير) 9 وفقد التمايز يحتمل النسخي. 6 اللاحقة دورة الخلية اعادة الدخول وانقسام الخلايا يتطلب فترات أطول الثقافة للاحتفال، خاصة إذا جولات متعددة من الانقسام هي الهدف التجريبي. أهمية الخلية دورة cardiomyocyte أمر أساسي لعدة أعمال العلمية الرئيسية الأخيرة في تجديد القلب، حيث تبين أن فقد التمايز وانتشار الخلايا العضلية الموجودة من قبل المسؤولين عن تجديد القلب في الزرد والفئران حديثي الولادة. 10-12 وهكذا، فإن إمكانية لتحفيز فقد التمايز ودورة الخلية اعادة الدخول في العضلية الكبار الثدييات يبقى السؤال الرئيسي في تجديد قلب الإنسان 13-15
أنا ن التجارب في المختبر دراسة دورة الخلية من القلب الثديياتوقد استخدمت myocytes في الغالب مصادر الفئران، نظرا لسهولة النسبية للثقافة على المدى الطويل مقارنة مع نماذج الماوس. 16 ومع ذلك، نظم الفئران توفر الموارد غنية من الأدوات المعدلة وراثيا تتميز بشكل جيد ونماذج المرض التي هي مفيدة في كل من في المختبر والمجراة البروتوكولات. على سبيل المثال، قد مكن تتبع النسب استنادا لجنة المساواة العرقية تحديد العضلية الموجودة مسبقا كمصدر للتجديد عضلة القلب في قلب فأر حديثي الولادة في الجسم الحي. 12 في الدراسات المختبرية العضلية الماوس حديثي الولادة، تتبع النسب مكنت دراسة التفاعلات مع انسجة الخلايا من خلال ثقافة مشتركة مع الخلايا الليفية. 5 ولكن نظرا لتحدياتها، وجود 17 تقارير قليلة من العزلة وطويلة الأجل ثقافة العضلية الماوس الكبار. 18،19
ومن المعروف ان عزلة العضلية الماوس الكبار قابلة للثقافة على المدى القصير وحدها أن تكون مهمة صعبة. هذا protocيوفر رأ خطوة بخطوة على تعليمات حول كيفية تحقيق العضلية قابلة للحياة من فئران بالغة التي يمكن أن تستخدم في كل من المدى القصير وكذلك التحقيقات على المدى الطويل. العضلية معزولة باستخدام هذا البروتوكول يمكن transduced بكفاءة مع ناقلات الفيروسة الغدانية 20،21 وتربيتها لمدة أسابيع. وتوفر هذه الأساليب نظام قوي لدراسة البيولوجيا cardiomyocyte في المختبر.
وتستند هذه الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة على عدة عناصر من الأعمال السابقة باستخدام أشكال مختلفة من نضح الوراء Langendorff. 18،22 وعلى الرغم من عدة بروتوكولات تم نشرها على عزل الخلايا العضلية الماوس الكبار للثقافة على المدى القصير والدراسة، 23-25 ميزة هذا البروتوكول هو القدرة على ثقافة العضلية معزولة على المدى الطويل. وسيكون هذا مفيدا في دراسة العمليات الخلوية التي تنطوي على التعبير الجيني خارج الرحم والتي تتطلب فترات طويلة من الوقت، كما هو الحال في استراتيجيات إعادة برمجة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الصحة العامة للالعضلية معزولة تعتمد على عدة جوانب هامة من هذا البروتوكول. أولا، الوقت من استخراج القلب لنضح أمر بالغ الأهمية ويجب أن يتم تنفيذ في 5 دقائق أو أقل. إزالة الكالسيوم يساعد على فصل التفاعلات خلية خلية، ولكن يمكن أن تؤثر سلبا على صحة الخلايا على المدى ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية الاختراق (ممولة جزئيا من قبل مؤسسة ساندلر)، والمعاهد الوطنية للصحة الطريق إلى جائزة الاستقلال (R00HL114738)، ومؤسسة إدوارد مالينكرودت الابن. وأيد JJ من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من المعاهد الوطنية للصحة (T32HL007731). الكتاب هي وحدها المسؤولة عن محتويات هذه الأعمال، التي لا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
