In Vitro Colony analyser for å karakterisere Tri-potente stamceller isolert fra den voksne Murine Pancreas

Summary

In vitro koloni analyser for å avdekke selvfornyelse og differensiering av stamceller isolert fra voksne murine bukspyttkjertelen er utviklet. I disse assays, pankreas forløpere gir opphav til cellekolonier i tre-dimensjonalt rom i metylcellulose inneholdende halvfast medium. Protokoller for håndtering av enkeltceller og karakterisering av individuelle kolonier er beskrevet.

Abstract

Stilk og progenitorceller fra den voksne bukspyttkjertelen kan være en potensiell kilde for terapeutiske beta-lignende celler for behandling av pasienter med type 1 diabetes. Det er imidlertid fremdeles ukjent hvorvidt stamceller og forløperceller eksisterer i den voksne bukspyttkjertelen. Forskningsstrategier ved hjelp av CRE-lox avstamning-sporing i voksne mus har gitt resultater som enten støtte eller avkrefte ideen om at beta-cellene kan genereres fra kanalene, den antatte stedet der voksne bukspyttkjertelen stamfedre kan ligge. Disse in vivo CRE-lox avstamning-sporing metoder, men kan ikke svare på spørsmål om selvfornyelse og multi-avstamning differensiering-to kriterier som er nødvendige for å definere en stamcelle. For å begynne å ta opp dette tekniske gap, utviklet vi tre-dimensjonale koloni analyser for bukspyttkjertelen stamfedre. Snart etter vår første utgivelse, andre laboratorier uavhengig utviklet en lignende, men ikke identisk, metode kalt organoid analysen. Sammenlignet med organoid analysen, benytter vår metodemetylcellulose, som danner viskøse løsninger som tillater inkludering av ekstracellulære matriksproteiner ved lave konsentrasjoner. De metylcellulose inneholder analyser tillate enklere gjenkjenning og analyser av stamceller ved encellede nivå, som er kritisk når stamfedre utgjør en liten sub-populasjon, slik tilfellet er for mange voksne organ stamceller. Sammen Resultatene fra flere laboratorier demonstrere in vitro selvfornyelse og multilineær differensiering av progenitorceller pankreas-liknende celler fra mus. De nåværende protokoller beskriver to metylcellulose baserte koloni analyser for å karakterisere mus bukspyttkjertelen stamfedre; en inneholder en kommersiell fremstilling av murine ekstracellulære matriksproteiner og den andre en kunstig ekstracellulære matriks-protein kjent som en laminin hydrogel. Teknikkene som vises her er 1) dissosiasjon i bukspyttkjertelen og sortering av CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ duktale celler fra voksne mus, 2) enkelt celle manipulering av sunderstøttes celler, 3) enkelt koloni analyser ved hjelp av mikrofluid QRT-PCR og hel-mount farging, og 4) dissosiasjon av primære kolonier i encellede suspensjoner og re-plating i videregående koloni analyser for å vurdere selvfornyelse eller differensiering.

Introduction

Bukspyttkjertelen er sammensatt av tre hovedcelle linjer; acinar cellene skiller ut fordøyelsesenzymer, kanaler skiller ut mucin å avverge patogener og transportere fordøyelsesenzymer til tarmen, og endokrine cellene skiller ut hormoner, inkludert insulin og glukagon, som opprettholder glukose homeostase. I løpet av den embryoniske utviklingen av bukspyttkjertelen, de tidlige ductal cellene er kilden for tri-potent stamceller som er i stand til å gi opphav til de tre linjene i pankreata av voksne dyr ^1,2. Ettersom voksne stamceller og forløperceller, slik som benmarg stamceller, er allerede med hell anvendes for å behandle ulike sykdommer ^3, er det stor interesse i å finne de stamceller og forløperceller i den voksne bukspyttkjertelen. Ved isolering og manipulering av voksne bukspyttkjertelen stilk og stamceller var mulig, kan disse cellene bli brukt til behandling av sykdommer så som type 1-diabetes, hvor de insulinsekreterende cellene blir ødelagt av autoimmunitet.

<p class = "jove_content"> Enten tri-potent stamceller fremdeles eksisterer hos voksne bukspyttkjertelen kanaler etter ferdigstillelse av embryoutvikling er et spørsmål som er sterkt debattert i det vitenskapelige miljøet. I denne debatten, og ved hjelp av in vivo CRE-lox avstamning-tracing teknikker, Inada og medarbeidere viste at voksne murine duktale celler merket med en markør, karboanhydrase II, kan gi opphav til alle tre bukspyttkjertelen linjene ^4. Men ved å bruke andre duktale markører, for eksempel HNF1b ⁵ og Sox9 ^2, ble det konkludert med at ductal celler er ikke den viktigste kilden til beta-cellene i voksen mus.

For flere år siden foreslo vi at årsaken til den foran nevnte debatt kan skyldes mangel, innen ^6,7, av hensiktsmessige analytiske verktøy som kan brukes til å måle selvfornyelse og multilineær differensierings to kriterier er nødvendig for å definere en stamcelle. In vivo CRE-lox avstamning-tracing teknikk nevntovenfor kan gi bevis for stamfar-avkom forhold på befolkningsnivå. Imidlertid er denne linjen tracing teknikk begrenset i sin makt for å avgjøre om enkelt stamceller kan fornye seg selv og skille ut flere linjene. Encellede analyse er viktig fordi hvis flere mono-potent stamfedre, hver med en annen avstamning potensial, ble analysert sammen, kan de kollektivt synes å ha multi-avstamning differensiering evner. I tillegg stamceller er vanligvis en mindre populasjon av en voksen organ. Virksomheten til en mindre celle befolkning kan bli maskert av den store befolkningen. Derfor ikke et negativt resultat fra en befolkningsundersøkelse ikke nødvendigvis indikerer fravær av stamceller. Til slutt, ikke cre-lox avstamning tracing for øyeblikket ikke at måling av selvfornyelse.

For å begynne å ta opp teknisk gap i feltet av pankreas stamcellebiologi, koloni ^7-11 eller ^12-15 organoid </sup> analyser ved hjelp av 3D-kultur systemene ble utviklet. To koloni-analyser for pankreas progenitorceller ble utviklet i vårt laboratorium: en inneholder en kommersiell fremstilling av murine ekstracellulære matriksproteiner (ECM) (se metoder og utstyr tabell), og den andre inneholder laminin hydrogel, en definert kunstig ECM protein ^7-11. Stamceller blandes i halvfast medium inneholdende metylcellulose. Methylcellulose er et biologisk inert og tyktflytende materiale fremstilt av trefibre, og har blitt rutinemessig brukt i blodkreft koloni analyser ^16. Den metylcellulose inneholdende halvfast medium begrenser bevegelsen av enkelt stamceller, slik at de ikke kan re-aggregat. Likevel er det medium myk nok til å tillate en stamceller til å vokse og differensiere til en koloni av celler i 3D-rommet. Etter tradisjonen av Hematologer, en bukspyttkjertelen stamceller som var i stand til å gi opphav til en koloni av celler var named en pankreatisk kolonidannende enhet (PCFU). PCFUs, når dyrket i murine ECM-holdige koloni analysen, gir opphav til cystisk kolonier som er navngitt "ring" kolonier ^7. Ved tilsetning av en Wnt agonist, R-spondin1, inn i murine ECM-holdige kultur, noen Ring koloniene slå inn "Tett" kolonier ^7. I denne artikkelen, er disse to typer av kolonier dyrket i murine ECM kultur kollektivt referert til som "Ring / tette" kolonier. Når ring / tette kolonier er dissosiert til enkelt celle suspensjon og re-belagt i kulturer som inneholder laminin hydrogel, "Endocrine / acinar" kolonier dannes ^7.

Ved hjelp av enkelt koloni analyser, ble det funnet at flertallet av Ring / Tette og endokrine / acinar kolonier, enten fra voksen (2-4 måneder gamle) ^7,11 eller ung (1 uke gammel) ⁹ murine bukspyttkjertelen, uttrykke alle tre Lineage markører. Dette tyder på at de fleste av de som kommer PCFUs er tri-potent. I murine ECM-holdige koloni analysen, voksen murine PCFUs robust selv fornye og utvide ca 500.000 ganger i løpet av 11 uker i kultur ^7. Murine ECM støtter fortrinnsvis differensieringen av celler ductal enn endokrine og acinar linjene, mens i nærvær av laminin hydrogel, er murine PCFUs oppfordres til å differensiere preferensielt inn i endokrine og akinærceller og i mindre grad til den duktal avstamning ^7,9,11. Viktigere, Insulin Glucagon ^{+ –} mono-hormonelle celler blir generert i laminin hydrogel kulturen og utskiller insulin som svar på glukose stimulering in vitro ^7,9, noe som tyder på funksjonell modenhet. Tri-avstamning differensiering potensial ^7,9 og selvfornyelse ¹¹ av individuelle PCFUs er bekreftet av encellede micromanipulation, dvs. dyrking av en celle per brønn for kolonidannelse. Sammen utgjør disse resultatene gir bevis for at det er selvfornyende, tri-pot, progenitor-lignende celler i postnatal murine bukspyttkjertelen som viser aktiviteter i 3D kultur.

De murine PCFU analysene beskrevet i denne artikkelen er hentet fra en tidligere koloni analysen designet for stamceller differensiert fra murine embryonale stamceller (mESCs) ^17. At protokollen er dokumentert i detalj i en annen Jove publikasjon ^18. Kultur komponenter og teknikker som er nødvendige for å utføre den murine ECM-inneholdende koloni assay for et voksent PCFUs er de samme som for Mesc-avledede stamceller ^17,18. Derfor vil disse aspektene av analysen ikke bli gjentatt her; i stedet følgende prosedyrer vil bli tatt opp: 1) dissosiasjon av den voksne bukspyttkjertelen og sortering CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ duktale celler, som beriker PCFUs fra voksen mus ^7, 2) encellede manipulering av de sorterte celler, 3) single-koloni analyser ved hjelp microfluidic QRT-PCR og hel-mount farging, og 4) dissosiasjon av Colonies inn enkeltcellesuspensjon og re-plating inn murine ECM eller laminin hydrogel koloni analyser.

Protocol

Etisk Uttalelse: Vi holder oss til de allment aksepterte etiske standarder i å drive forskning for å sikre kvalitet og integritet av resultatene. Dyreforsøk er gjennomført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité på City of Hope. 1. Forbered Single-celle Suspensjon fra Adult Murine pankreata MERK: I tidligere publikasjoner 7,11, ble CD-en eller B6 bakgrunns mus som brukes; begge bakgrunn ga lignende resultater. En transgen muselinje (betegnet Sox9 / EG…

Representative Results

Voksen bukspyttkjertelen stamceller kan bli beriket av fluorescens-aktivert celle sortering (figur 1). Den Sox9 / EGFP transgen muselinje som brukes her først ble generert som et resultat av den GENSAT Brain Atlas Prosjekt 19, og den EGFP reporteren er under kontroll av et bakterielt kunstig kromosom inneholdende ~ 75 kb oppstrøms og ~ 150 kb nedstrøms-sekvensene i Sox9 20 . I disse musene, etiketter EGFP pancreatic kanaler effektivt og spesielt …

Discussion

Pancreatic koloni analyser og enkelt koloni analyser beskrevet her ble inspirert av metylcellulose holdige blodkreft koloni analyser som har spilt viktige roller i å tyde biologi blodkreft stamceller i de siste tiårene ^23. I disse analyser (figur 5), dissosiert pankreatiske celler blir sådd ut i metylcellulose inneholdende halvfaste medier med passende vekstfaktorer og ECM proteiner som fremmer dannelsen av Ring, tett eller endokrine / acinar kolonier ^7. En enkelt stamceller som…

Materials

Murine ECM proteins (Matrigel)	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	354230	Stock kept at -20oC
Laminin Hydrogel	Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)		Stock kept at -20oC
Methylcellulose	Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)		1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Mediatech (Manassas, VA, USA)	21-031-CV
Phosphate Buffered Saline	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063
50mL Flacon Conical vial	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	352070
100mmx20mm Suspension culture dish	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	430591
Bovine Serum Albumin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412
Penicillin/Streptomycin	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063
DNase1	Calbiochem (Darmstadt, Germany)	260913
Collagenase B	Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)	11088831001	Stock kept at -20oC
Anti-mouse CD16/32	Biolegend (San Diego, CA, USA)	101310	low endotoxin, azide free
PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control	Biolegend (San Diego, CA, USA)	400522
Rat IgG1 κ Isotype Control	eBioscience (San Diego, CA, USA)	13-4301-82
Anti-CD133-Biotin	eBioscience (San Diego, CA, USA)	13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7	Biolegend (San Diego, CA, USA)	113812
Streptavidin-Allophycocyanin	Biolegend (San Diego, CA, USA)	405207
4',6-Diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	3571	Stock kept at -20oC
Anti-mucin 1	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)	HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Mediatech(Manassas, VA, USA)	10-092-CV
Fetal Bovine Serum	Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)	101	Stock kept at -20oC
Tris Ethylenediaminetetraacetic acid	TEKnova (Hollister, CA, USA)	T0221
Rneasy Micro Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	74004
QuantiTec Reverse Transcription Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)	11753-100
Paraformaldehyde	Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)	SC-281692
Goat serum	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	005-000-121	Stock kept at -20oC
Donkey serum	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	0017-000-121	Stock kept at -20oC
Triton X-100	Sigma (St. Louis, MO, USA)	T9284
Trypsin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	T-4799
Ethylenediaminetetraacetic acid	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	15575-020
Trypsin-EDTA	Life Technologies (Waltham, MA, USA)	25200-056
Sterile Water	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15230-147	Molecular biology grade
Pasteur Pipette	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	13-678-8B
40um Filter Mesh	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	08-771-1
70 um filter mesh	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	08-771-2
TC Plate 96 Well Suspension	Sarstedt	83.3924 (Previously 83.1835)
1cc Syringe	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	309659
10cc Syringe	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	301604
48.48 Dyanmic Array Chip	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)	BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)	85000800
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)	4304437
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P7949
Glass Bottom Dish	MatTek (Ashland, MA, USA)	P35G-1.5-14-C	35 mm petri dish with glass bottom
Mouth Piece/ Rubber Tubing	Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)	MP-SET
Nicotinamide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	N0636	Stock kept at -20oC
Vascular Endothelial Growth Factor	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	293-VE	Stock kept at -80oC
Activin B	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	659-AB	Stock kept at -80oC
Extendin 4	Sigma (St. Louis, MO, USA)	E7144	Stock kept at -20oC
Rspondin-1	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	3474-RS	Stock kept at -80oC
Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	352054
PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	305196
PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	3473
Costar 96 Black Well Plate	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	3603	Flat, clear bottom with lid.  Black polystyrene TC-treated microplates
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope	Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)
Biomark HD	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell Sorter	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)