In Vitro Колонии Assays Характеризуя Tri-сильнодействующие прогениторных клеток , выделенных из мышиной поджелудочной железы для взрослых
Summary
В пробирке колонии анализов для выявления самообновления и дифференцировки клеток – предшественников , выделенных из взрослых мышиных поджелудочной железы разработаны. В этих анализах, панкреатические клетки-предшественники вызывают клеточных колоний в 3-мерном пространстве в метилцеллюлозы, содержащей полутвердой среде. Протоколы для обработки отдельных клеток и определение характеристик отдельных колоний описаны.
Abstract
Стволовые и клетки-предшественники из взрослых поджелудочной железы может быть потенциальным источником терапевтических бета-подобных клеток для лечения пациентов с сахарным диабетом 1 типа. Тем не менее, до сих пор неизвестно, существуют ли стволовые клетки и клетки-предшественники во взрослой поджелудочной железы. Стратегии исследований с использованием Cre-LOX родословная-трассировку у взрослых мышей, дали результаты, которые поддерживают или опровергают идею, что бета-клетки могут быть получены из каналов, предполагаемого места, где взрослые панкреатические клетки-предшественники могут постоянно находиться. Эти в естественных условиях CRE-LOX LINEAGE-трассировку методы, однако, не может ответить на вопросы самообновлению и мульти-линии дифференцировки дифференциацию двух критериев , необходимых для определения стволовых клеток. Для того, чтобы приступить к решению этого технического разрыва, мы разработали 3-мерные колонии анализов для панкреатических клеток-предшественников. Вскоре после нашей первой публикации, другие лаборатории, независимо друг от друга разработали аналогичный, но не идентичный, метод называется Органоид анализа. По сравнению с Органоид анализа, наш метод используетметилцеллюлоза, которая образует вязкие растворы, которые позволяют включение белков внеклеточного матрикса при низких концентрациях. Метилцеллюлоза, содержащие анализы позволяют более легкого обнаружения и анализа клеток-предшественников на уровне одной клетки, которые имеют решающее значение, когда клетки-предшественники представляют собой небольшую субпопуляцию, как это имеет место для многих взрослых стволовых клеток органа. Вместе результаты нескольких лабораторий демонстрируют в пробирке самообновлению и мульти-клонального дифференциации панкреатических клеток- предшественников-подобных клеток мышей. Существующие протоколы описывают два метилцеллюлозы на основе колонии анализов для характеризации мыши панкреатических клеток-предшественников; одна из них содержит промышленный препарат мышиных белков внеклеточного матрикса, а другой искусственный внеклеточного матрикса белок, известный как ламинин гидрогеля. Методы , представленные здесь , являются : 1) диссоциация поджелудочной железы и сортировки CD133 + Sox9 / EGFP + протоковой клетки из взрослых мышей, 2) манипуляция одноклеточ- сorted клетки, 3) одну колонию анализа с использованием микрожидкостных QRT-PCR и целом монтажа иммуноокрашивания и 4) диссоциации первичных колоний в одноклеточных суспензий и повторное покрытие во вторичные колонии анализов для оценки самообновления или дифференцировки.
Introduction
Поджелудочная железа состоит из трех основных клеточных линий; ацинарных клетки секретируют пищеварительные ферменты, протоки секретируют муцин, чтобы парировать патогены и транспортировать пищеварительные ферменты в кишечнике, и эндокринные клетки секретируют гормоны, включая инсулин и глюкагон, которые поддерживают гомеостаз глюкозы. Во время эмбрионального развития поджелудочной железы, ранние протоковой клетки являются источником тримарана сильнодействующим клеток – предшественников , способных привести к трем родословных в поджелудочных желез у взрослых животных 1,2. Потому что взрослые стволовые клетки и клетки – предшественники, такие как стволовые клетки костного мозга, которые уже успешно используются для лечения различных заболеваний 3, есть повышенный интерес в поиске стволовых клеток и клеток – предшественников во взрослой поджелудочной железы. Если изоляция и манипулирование взрослыми панкреатических стволовых клеток и клеток-предшественников, было возможно, эти клетки могут быть использованы для лечения заболеваний, таких как сахарный диабет типа 1, в котором секретирующих инсулин клетки разрушаются аутоиммунной реакцией.
<p class = "jove_content"> Является ли три- сильнодействующих клетки-предшественники до сих пор существуют у взрослых протоков поджелудочной железы после завершения эмбрионального развития является вопрос, который сильно обсуждается в научном сообществе. В этой дискуссии, и используя в естественных условиях CRE-LOX родословная трассировки методов, Inada и его коллеги показали , что взрослые мышиные протоковой клетки , меченные маркером, карбоангидразы II, может привести ко всем трем панкреатических родословных 4. Тем не менее, с помощью других протоков маркеры, такие как HNF1b 5 и Sox9 2, был сделан вывод о том , что протоковой клетки не являются основным источником бета – клеток у взрослых мышей.Несколько лет назад, мы предположили , что причиной вышеупомянутой дискуссии может быть связано с отсутствием в области 6,7, соответствующих аналитических инструментов , которые могут быть использованы для измерения самообновление и мульти-родословие дифференцировку два критерия , необходимые для определяют стволовой клетки. В естественных условиях CRE-LOX родословная-трассировку техника упоминалосьвыше может предоставить доказательства взаимосвязи прародитель-потомка на уровне населения. Тем не менее, этот метод трассировки родословная ограничен в его силах, чтобы различить ли отдельные клетки-предшественники могут самообновлению и дифференцировке в множественные клоны. Анализ Одноклеточный важно, потому что если несколько моно-сильнодействующим клетки-предшественники, каждый с разным фамилиям потенциалом, были проанализированы вместе, они могут в совокупности по всей видимости, имеют мульти-клональные дифференциации способностей. Кроме того, стволовые клетки, как правило, незначительная популяция взрослого органа. Деятельность незначительной популяции клеток может быть замаскирован основным населением. Таким образом, отрицательный результат из исследования населения не обязательно указывает на отсутствие стволовых клеток. И, наконец, трассировка CRE-LOX родословная в настоящее время не позволяют измерять самообновлению.
Для того, чтобы приступить к решению технического разрыва в области поджелудочной предшественников клеточной биологии, колонии или 7-11 Органоид 12-15 </suр> анализы с использованием 3D-систем культуры были разработаны. Две колонии анализы для панкреатических клеток – предшественников были разработаны в нашей лаборатории: одна из них содержит промышленный препарат мышиных белков внеклеточного матрикса (ECM) (см методы и оборудование таблицу), а другой содержит ламинин гидрогель, определенный искусственный ECM белок 7-11. Клетки-предшественники смешиваются в полу-твердой среде, содержащей метилцеллюлозу. Метилцеллюлоза является биологически инертным и вязкий материал , полученный из древесных волокон, и постоянно используется в гемопоэтические колонии анализов 16. Метилцеллюлозы, содержащей полутвердую среду ограничивает движение отдельных клеток-предшественников, так что они не могут повторно агрегат. Тем не менее, среда достаточно мягким, чтобы позволить клетки-предшественника, чтобы расти и дифференцироваться в колонию клеток в 3D-пространстве. Следуя традициям гематологов, панкреатический клеток-предшественников, которые были способны дать начало колонии клеток была пAMED панкреатический колониеобразующих единицы (PCFU). PCFUs, при выращивании в анализе колонии мышиного ECM-содержащие, приводят к кистозной колоний, которые называются "Кольцо" 7 колоний. При добавлении агониста Wnt, R-spondin1, в мышиной ECM-содержащие культуры, некоторые колонии кольца превращаются в "Плотная" колонии 7. В этой статье, эти два типа колоний, выращенных в мышиной ECM культуры совместно именуются как "Ring / Плотные" колоний. Когда кольцо / Плотные колонии диссоциируют на одной клеточной суспензии и повторно высевали в культурах, содержащих ламинина гидрогель, "Эндокринные / Железистый" колонии образуются 7.
Используя одну колонию анализа, было установлено , что большинство Ring / Плотные и эндокринная / ацинарными колоний, либо из взрослых (2-4 месяца назад) 7,11 или молодой (1-недельных) 9 мышиной поджелудочной железы, выразить все три линии преемственности маркеров. Это говорит о том, что большинство происходящих PCFUs являются три-сильнодействующим, В анализе колонии мышиного ECM-содержащий, взрослый мышиный PCFUs робастно самообновлению и расширить примерно 500000 раз за 11 недель в культуре 7. Мышиные ECM преимущественно поддерживает дифференциацию клеток протоков над эндокринных и ацинарных родословных, в то время как в присутствии ламинина гидрогеля, мышиные PCFUs предлагается дифференцировать преимущественно в эндокринных и ацинарных клеток и в меньшей степени к протоковой линии 7,9,11. Важно отметить, что инсулин + Глюкагон – моно-гормональный клетки образуются в ламининовым гидрогеля культуры и секреции инсулина в ответ на глюкозу стимуляции в пробирке 7,9, предполагая функциональную зрелость. Дифференциация три- родословная потенциал и 7,9 самообновление 11 индивидуальных PCFUs подтверждаются одноклеточного микроманипуляций, т.е. культивировании одну клетку на лунку для образования колоний. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что существуют самообновлению, три-POTENт, прогениторные-подобные клетки в послеродовом мышиной поджелудочной железы, которые показывают деятельность в 3D культуры.
Мышиные PCFU анализов , описанных в этой статье , получены из анализа предварительного колонии , предназначенной для клеток – предшественников дифференцируются из мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs) 17. Этот протокол подробно задокументированы в другой публикации Jove 18. Компоненты и методы , необходимые для выполнения мышиный ECM-содержащий анализ колонии для взрослых PCFUs культуры такие же , как для MESC-производных клеток – предшественников 17,18. Таким образом, не будет повторяться здесь эти аспекты анализа; вместо того, чтобы следующие процедуры будут рассмотрены: 1) диссоциация взрослого поджелудочной железы и сортировки CD133 + Sox9 / EGFP + протоков клетки, которые обогащают PCFUs от взрослых мышей 7, 2) манипуляции с одноклеточного отсортированного клеток, 3) одной колонии анализ с использованием микрожидкостных QRT-PCR и целом монтажа иммуноокрашивания и 4) диссоциации Colonies в суспензию одноклеточных и повторно металлизированный в мышиной ECM или ламинина гидрогель колонии анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В панкреатических колонии анализы и одну колонию анализов , описанных здесь , были вдохновлены метилцеллюлозы содержащих гемопоэтические колонии анализов , которые сыграли важную роль в расшифровке биологии гемопоэтических клеток – предшественников в последние десятилетия 23. В…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Люси Браун и Александр Спалла из аналитической цитометрии Ядро в Город надежды на помощь в сортировке. Эта работа частично поддержана Национальным институтом здравоохранения (NIH) предоставляет R01DK081587 и R01DK099734 к HTK и U01DK089533 к ДОПОГ, а также Институтом Национального научного фонда грант NSF-DMR-1206121 и California для регенеративной медицины грант RB5-07398 для DAT Supports от Джозефа Дж Jacobs Института молекулярной инженерии для медицины Калифорнийского технологического института в DAT, а также тех, кто из Окснард Фонда и Эллы Фицджеральд Фонда к HTK также с благодарностью.
Финансирование: Эта работа частично поддержана Национальным институтом здравоохранения (NIH) гранты R01DK081587 и R01DK099734 к HTK и U01DK089533 к ДОПОГ, и Институтом Национального научного фонда грант NSF-DMR-1206121 и California для регенеративной медицины грант RB5-07398 в Поддержка DAT от Joseph J. JacobsИнститут молекулярной инженерии для медицины Калифорнийского технологического института в DAT, а те из Окснард Фонда и Эллы Фицджеральд Фонда к HTK также с благодарностью. В исследовании, опубликованном в данной публикации, включены работы, выполненные в аналитической цитометрии ядра и световой микроскопии Digital Imaging Ядро при поддержке Национального института рака Национального института здоровья под номером награду P30CA33572.
Исследование спонсор: Спонсор не принимал участия в исследовании разработки, сбора, анализа или интерпретации данных.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells–recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
