Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

Jacob R. Tremblay; Jeanne M. LeBon; Angela Luo; Janine C. Quijano; Lena Wedeken; Kevin Jou; Arthur D. Riggs; David A. Tirrell; H. Teresa Ku

doi:10.3791/54016

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Artículo de método

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

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DOI:

10.3791/54016

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10 de junio de 2016

Jacob R. Tremblay^*¹^,² , Jeanne M. LeBon^*¹ , Angela Luo¹ , Janine C. Quijano¹ , Lena Wedeken¹ , Kevin Jou¹ , Arthur D. Riggs¹ , David A. Tirrell³ , H. Teresa Ku¹

¹Diabetes and Metabolism Research Institute, Beckman Research Institute of City of Hope, ²Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, ³Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En ensayos de colonias in vitro para la detección de auto-renovación y diferenciación de células progenitoras aisladas de páncreas murinos adultos estén concebidas. En estos ensayos, los progenitores de páncreas dan lugar a colonias de células en el espacio de 3 dimensiones en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Se describen protocolos para la manipulación de células individuales y caracterización de las colonias individuales.

Resumen

Madre y células progenitoras de páncreas adulto podría ser una fuente potencial de las células beta-como terapéuticos para el tratamiento de pacientes con diabetes tipo 1. Sin embargo, todavía no se sabe si existen células madre y progenitoras en el páncreas adulto. Las estrategias de investigación que utilizan cre-lox linaje de trazado en ratones adultos han arrojado resultados que apoyar o refutar la idea de que las células beta pueden ser generados a partir de los conductos, el presunto lugar donde adultos progenitores pancreáticos pueden residir. Estos métodos de trazado de linaje in vivo cre-lox, sin embargo, no pueden responder a las preguntas de auto-renovación y diferenciación de dos criterios múltiples linajes necesarios para definir una célula madre. Para empezar a solucionar esta brecha técnica, ideamos ensayos de colonias en 3 dimensiones para progenitores pancreáticos. Poco después de nuestra primera publicación, otros laboratorios desarrollaron independientemente un similar, pero no idéntica, método llamado el ensayo organoid. En comparación con el ensayo organoide, nuestro método empleametilcelulosa, que forma soluciones viscosas que permiten la inclusión de proteínas de matriz extracelular en bajas concentraciones. Los ensayos que contiene metilcelulosa, permiten la detección y el análisis de las células progenitoras a nivel de una sola célula, que son críticos cuando los progenitores constituyen una pequeña subpoblación más fácil, como es el caso de muchas células madre adultas de órganos. En conjunto, los resultados de varios laboratorios demuestran in vitro auto-renovación y multi-linaje diferenciación de células progenitoras similar pancreáticas de ratones. Los protocolos actuales describen dos ensayos de colonias a base de metilcelulosa para caracterizar progenitores pancreáticos de ratón; uno contiene una preparación comercial de proteínas de la matriz extracelular murino y el otro una proteína de matriz extracelular artificial conocido como un hidrogel laminina. Las técnicas que se muestran aquí son 1) disociación del páncreas y la clasificación de CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ células ductales de ratones adultos, 2) la manipulación sola célula de las scélulas orted, 3) sola colonia análisis usando microfluidos QRT-PCR y todo el montaje inmunotinción, y 4) la disociación de las colonias primarias en una sola célula suspensiones y re-chapado en ensayos de colonias secundarias para evaluar la auto-renovación o diferenciación.

Introducción

El páncreas se compone de tres grandes linajes de células; Las células acinares segregan enzimas digestivas, conductos secretan mucina para defenderse de patógenos y el transporte de las enzimas digestivas en el intestino, y las células endocrinas secretan hormonas, como la insulina y el glucagón, que mantienen la homeostasis de la glucosa. Durante el desarrollo embrionario del páncreas, las células ductales primeros son la fuente de las células progenitoras tri-potente capaz de dar lugar a los tres linajes en el páncreas de animales adultos ^1,2. Dado que las células madre y progenitoras adultas, tales como células madre de médula ósea, ya se utilizan con ....