Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas
Summary
En ensayos de colonias in vitro para la detección de auto-renovación y diferenciación de células progenitoras aisladas de páncreas murinos adultos estén concebidas. En estos ensayos, los progenitores de páncreas dan lugar a colonias de células en el espacio de 3 dimensiones en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Se describen protocolos para la manipulación de células individuales y caracterización de las colonias individuales.
Abstract
Madre y células progenitoras de páncreas adulto podría ser una fuente potencial de las células beta-como terapéuticos para el tratamiento de pacientes con diabetes tipo 1. Sin embargo, todavía no se sabe si existen células madre y progenitoras en el páncreas adulto. Las estrategias de investigación que utilizan cre-lox linaje de trazado en ratones adultos han arrojado resultados que apoyar o refutar la idea de que las células beta pueden ser generados a partir de los conductos, el presunto lugar donde adultos progenitores pancreáticos pueden residir. Estos métodos de trazado de linaje in vivo cre-lox, sin embargo, no pueden responder a las preguntas de auto-renovación y diferenciación de dos criterios múltiples linajes necesarios para definir una célula madre. Para empezar a solucionar esta brecha técnica, ideamos ensayos de colonias en 3 dimensiones para progenitores pancreáticos. Poco después de nuestra primera publicación, otros laboratorios desarrollaron independientemente un similar, pero no idéntica, método llamado el ensayo organoid. En comparación con el ensayo organoide, nuestro método empleametilcelulosa, que forma soluciones viscosas que permiten la inclusión de proteínas de matriz extracelular en bajas concentraciones. Los ensayos que contiene metilcelulosa, permiten la detección y el análisis de las células progenitoras a nivel de una sola célula, que son críticos cuando los progenitores constituyen una pequeña subpoblación más fácil, como es el caso de muchas células madre adultas de órganos. En conjunto, los resultados de varios laboratorios demuestran in vitro auto-renovación y multi-linaje diferenciación de células progenitoras similar pancreáticas de ratones. Los protocolos actuales describen dos ensayos de colonias a base de metilcelulosa para caracterizar progenitores pancreáticos de ratón; uno contiene una preparación comercial de proteínas de la matriz extracelular murino y el otro una proteína de matriz extracelular artificial conocido como un hidrogel laminina. Las técnicas que se muestran aquí son 1) disociación del páncreas y la clasificación de CD133 + Sox9 / EGFP + células ductales de ratones adultos, 2) la manipulación sola célula de las scélulas orted, 3) sola colonia análisis usando microfluidos QRT-PCR y todo el montaje inmunotinción, y 4) la disociación de las colonias primarias en una sola célula suspensiones y re-chapado en ensayos de colonias secundarias para evaluar la auto-renovación o diferenciación.
Introduction
El páncreas se compone de tres grandes linajes de células; Las células acinares segregan enzimas digestivas, conductos secretan mucina para defenderse de patógenos y el transporte de las enzimas digestivas en el intestino, y las células endocrinas secretan hormonas, como la insulina y el glucagón, que mantienen la homeostasis de la glucosa. Durante el desarrollo embrionario del páncreas, las células ductales primeros son la fuente de las células progenitoras tri-potente capaz de dar lugar a los tres linajes en el páncreas de animales adultos 1,2. Dado que las células madre y progenitoras adultas, tales como células madre de médula ósea, ya se utilizan con éxito para el tratamiento de diversas enfermedades 3, hay un gran interés en la búsqueda de las células madre y progenitoras en el páncreas adulto. Si el aislamiento y la manipulación de células madre y progenitoras pancreáticas adultas eran posibles, estas células podrían utilizarse para tratar enfermedades tales como la diabetes tipo 1, en el que las células secretoras de insulina se destruyen por autoinmunidad.
<p class = "jove_content"> si las células progenitoras tri-potente todavía existen en los conductos pancreáticos adultos después de la finalización del desarrollo embrionario es una cuestión que está muy debatido en la comunidad científica. En este debate, y el uso in vivo cre-lox linaje de trazado de técnicas, Inada y colaboradores demostraron que las células ductales murinos adultos marcados con un marcador, anhidrasa carbónica II, podrían dar lugar a los tres linajes pancreáticos 4. Sin embargo, utilizando otros marcadores ductales, como HNF1B 5 y Sox9 2, se concluyó que las células ductales no son la principal fuente de las células beta en ratones adultos.Hace varios años, hemos propuesto que la causa del mencionado debate puede ser debido a la falta, en el campo de 6,7, de herramientas analíticas adecuadas que se pueden utilizar para medir la auto-renovación y multi-linaje de diferenciación y dos criterios necesarios para definir una célula madre. El vivo cre-lox técnica de trazado de linaje en el mencionadoanterior puede proporcionar evidencia de la relación progenitor-hijo en un nivel de población. Sin embargo, esta técnica de rastreo de linaje está limitada en su poder de discernir si las células progenitoras individuales pueden auto-renovarse y diferenciarse en múltiples linajes. El análisis de una sola célula es importante porque si varios progenitores mono-potente, cada uno con un potencial de linaje diferente, se analizaron en conjunto, pueden aparecer colectivamente tener capacidades de diferenciación de múltiples linajes. Además, las células madre son por lo general una población menor de un órgano adulto. Las actividades de una población de células de menor importancia podrían ser enmascarados por la importante población. Por lo tanto, un resultado negativo de un estudio de la población no indica necesariamente la ausencia de células madre. Por último, el trazado de cre-lox linaje actualmente no permiten la medición de auto-renovación.
Para empezar a solucionar la brecha técnica en el campo de la biología de células progenitoras de páncreas, colonia 7-11 o 12-15 organoid </suSe idearon p> ensayos que utilizan sistemas de cultivo en 3D. Dos ensayos de colonias de progenitores pancreáticos se han desarrollado en nuestro laboratorio: uno contiene una preparación comercial de proteínas murinas de la matriz extracelular (ECM) (ver Métodos y equipos de mesa), y el otro contiene hidrogel laminina, una proteína artificial ECM definido 7-11. Las células progenitoras se mezclan en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Metilcelulosa es un material biológicamente inerte y viscoso preparado a partir de fibras de madera, y se ha utilizado de forma rutinaria en ensayos de colonias hematopoyéticas 16. El medio semi-sólido que contiene metilcelulosa-restringe el movimiento de las células progenitoras individuales de manera que no pueden volver a agregado. Sin embargo, el medio es lo suficientemente suave para permitir que una célula progenitora para crecer y diferenciarse en una colonia de células en el espacio 3D. Siguiendo la tradición de los hematólogos, una célula progenitora pancreática que era capaz de dar lugar a una colonia de células era named una unidad formadora de colonias de páncreas (PCFU). PCFUs, cuando se cultiva en el ensayo de colonias que contiene ECM-murino, dan lugar a colonias quísticas que se denominan colonias "anillo" 7. Tras la adición de un agonista de Wnt, R-spondin1, en el cultivo que contiene ECM-murino, algunas colonias del anillo se convierten en colonias "densos" 7. En este artículo, estos dos tipos de colonias crecidas en cultivo ECM murino se conocen colectivamente como "anillo colonias / densos". Cuando el anillo / Densas colonias se disocian en suspensión de células individuales y re-chapada en cultivos que contienen hidrogel laminina, colonias "Endocrino / acinares" se forman 7.
El uso de una sola colonia de análisis, se encontró que la mayoría de las colonias Anillo / denso y Endocrino / acinares, ya sea de adultos (2-4 meses de edad) 7,11 o jóvenes (1 semana de edad) 9 páncreas murino, expresan los tres marcadores de linaje. Esto sugiere que la mayoría de los PCFUs originarios se tri-potente. En el ensayo de colonias que contiene ECM-murino, adulto PCFUs murino robusta auto-renovarse y ampliar aproximadamente 500.000 veces más de 11 semanas en la cultura 7. ECM murino preferentemente apoya la diferenciación de células ductales más de endocrinos y acinares linajes, mientras que en presencia de hidrogel laminina, se anima a PCFUs murinos para diferenciar preferentemente en células endocrinas y acinares y en menor medida con el linaje ductal 7,9,11. Es importante destacar que, Insulina + Glucagon – células mono-hormonal se generan en la cultura de hidrogel laminina y secretan insulina en respuesta a la estimulación de glucosa in vitro 7,9, lo que sugiere la madurez funcional. La diferenciación tri-linaje potencial 7,9 y auto-renovación 11 de PCFUs individuales son confirmados por micromanipulación de una sola célula, es decir, el cultivo de una célula por pocillo para la formación de colonias. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que hay auto-renovación, tri-potenT, células progenitoras-como en el páncreas murino posnatal que muestran actividades en cultivo 3D.
Los ensayos PCFU murinos descritos en este artículo se derivan de un ensayo de colonias antes diseñado para células progenitoras diferenciadas a partir de células madre embrionarias murinas (mESCs) 17. Dicho protocolo se documenta en detalle en otra publicación JoVe 18. Los componentes y las técnicas necesarias para llevar a cabo el ensayo de colonias que contiene ECM-murino para PCFUs adultos de cultivo son los mismos que para los progenitores derivados de mESC 17,18. Por lo tanto, no se repetirán aquí estos aspectos del ensayo; en su lugar se abordarán los siguientes procedimientos: 1) la disociación del páncreas adulto y clasificación + células ductales CD133 + Sox9 / EGFP, que enriquecen PCFUs de ratones adultos 7, 2) la manipulación de una sola célula de las células clasificadas, 3) de una sola colonia análisis utilizando microfluidos QRT-PCR y todo el montaje inmunotinción, y 4) la disociación de colonies en la suspensión de una sola célula y re-chapado en ECM murino o ensayos de colonias de hidrogel de laminina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ensayos de colonias pancreáticas y única colonia análisis descritos aquí se inspiraron en los ensayos de colonias hematopoyéticas que contiene metilcelulosa, que han jugado un papel importante en el desciframiento de la biología de las células progenitoras hematopoyéticas en las últimas décadas 23. En estos ensayos (Figura 5), disocian las células pancreáticas se sembraron en medios semisólidos con factores de crecimiento adecuados y proteínas ECM que apoyan la formación de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Lucy Brown y Alejandro Spalla de la analítica Citometría Core en City of Hope de asistencia en la clasificación. Este trabajo está apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) subvenciones R01DK081587 y R01DK099734 a HTK, y U01DK089533 de ADR, y por la National Science Foundation NSF-DMR-1206121 y California Instituto de Medicina Regenerativa RB5-07398 subvención a DAT Apoyos del Instituto J. Joseph Jacobs de Ingeniería Molecular de Medicina en Caltech a DAT, y los de la Fundación Fundación Oxnard y Ella Fitzgerald a HTK son también agradece.
Financiación: Este trabajo está apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y otorga R01DK081587 R01DK099734 a HTK, y U01DK089533 de ADR, y por la National Science Foundation NSF-DMR-1206121 y California Instituto de Medicina Regenerativa de subvención RB5-07398 Soporta DAT de la Joseph J. JacobsInstituto de Ingeniería Molecular de Medicina en Caltech a DAT, y los de la Fundación Fundación Oxnard y Ella Fitzgerald a HTK también se agradece. Las investigaciones realizadas en esta publicación, se incluyó el trabajo realizado en la analítica de Citometría y Microscopía de Luz Core Digital Imaging Core apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud con el número P30CA33572 premio.
Patrocinador del estudio: El patrocinador no participó en el diseño del estudio, la recogida, análisis o interpretación de los datos.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells–recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
