RNA Zuivering van Intracellulair Grown<em> Listeria monocytogenes</em> In macrofaag-cellen
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Intracellulaire bacteriële pathogenen ─ bacteriën die infectieziekten en kunnen groeien en reproduceren in de cellen van menselijke gastheren ─ zijn een belangrijk gezondheidsprobleem wereldwijd 5. Binnen te vallen en te repliceren binnen een zoogdiercel, hebben intracellulaire pathogenen verfijnde virulentie mechanismen en factoren verworven. Hoewel deze zijn essentieel voor het vermogen om een ziekte te veroorzaken, weten we weinig over hun regulatie en dynamiek. Aangezien genexpressieprofielen bacteriën gekweekt in vloeibaar medium niet de werkelijke omgeving binnen gastheercellen weerspiegelen, is er een groeiende behoefte aan transcriptoom analyse bacteriën gekweekt in hun intracellulaire niches. Dergelijke analyses zullen de ontcijfering van specifieke bacteriële aanpassingen naar aanleiding van de gastheer mogelijk te maken en zal helpen om nieuwe targets te identificeren voor therapeutische design. Transcriptoom analyse van intracellulaire bacteriën gekweekt zeer uitdagend omdat zoogdier RNA overtreffen bacterieel RNA met tenminste tienvoudige. In dit manuscript beschrijven we een experimentele methode om bacteriële RNA isoleren van Listeria monocytogenes bacteriën groeien binnen muizen macrofaag cellen. Het geëxtraheerde RNA kan worden gebruikt om intracellulaire aanpassingen en virulentiemechanismen van pathogene bacteriën met verschillende technieken van transcriptie analyse, zoals RT-PCR, RNA-Seq, microarray en andere op hybridisatie gebaseerde technieken bestuderen.
L. monocytogenes is de verwekker van listeriose bij de mens, een ziekte met klinische verschijnselen die vooral op immuungecompromitteerde personen, ouderen en zwangere vrouwen 6. Het een Gram-positieve facultatief intracellulaire pathogeen dat een breed scala aan zoogdiercellen die al tientallen jaren als model gastheer-pathogeen interacties bestudeert 7 binnendringt. Bij invasie, verblijft het eerst in een vacuole of phagosome (bij fagocytische cellen), waaruit moet ontsnappen in tHij gastheercel cytosol om te repliceren. Verscheidene virulentiefactoren is aangetoond dat de ontsnapping proces, voornamelijk de porievormende hemolysine, listeriolysine O (LLO) en twee extra fosfolipasen 8 mediëren. In het cytosol gebruiken de bacteriën de gastheer actine polymerisatie machines zich voortbewegen op actine filamenten in de cel en verspreiding van cel naar cel (figuur 1). Alle belangrijke virulentiefactoren van L. monocytogenes die betrokken zijn bij de invasie, intracellulaire overleving en replicatie, worden geactiveerd door de master virulentie transcriptie regulator, PRFA. 8-10.
In de afgelopen tien jaar verschillende studies uitgevoerd door ons en anderen hebben met succes toegepast methoden voor de transcriptoom analyse van intracellulaire gegroeid bacteriën in gastheercellen 2,11-15. Twee benaderingen worden gebruikt om bacteriële RNA te scheiden van gastheer-RNA dat is gebaseerd op: 1) Selectieve verrijking van bacteriële RNA en 2) RNA-isolatie door differential cellysis. De eerste benadering is gebaseerd op subtractieve hybridisatie van totaal RNA-extracten van zoogdieren RNA-moleculen (bijvoorbeeld met behulp van commercieel verkrijgbare kits) of selectieve vangen van bacteriële getranscribeerde sequenties (SCOTS) 11. De tweede benadering is gebaseerd op differentiële lysis van bacteriën en gastheercellen, waarbij de gastheercellen worden gelyseerd terwijl bacteriële cellen intact blijven. Bacteriële cellen worden vervolgens gescheiden van de gastheer cellysaat, gewoonlijk door centrifugeren, en het RNA wordt geëxtraheerd onder toepassing van standaardtechnieken. Het grootste probleem met deze benadering is dat samen met de intacte bacteriën gastheercellen kernen zijn ook geïsoleerde, waardoor het RNA preparaten zoogdier RNA bevatten nog steeds. Een manier om dit probleem te overwinnen is intacte bacteriën te scheiden van gastheercellen kernen met behulp van differentiële centrifugatie, maar dit neemt doorgaans tijd die het probleem van veranderingen in genexpressie profiel tijdens extractie. In dit artikel geven we een betere en snelle bacteria RNA-extractie protocol, dat is gebaseerd op differentiële cel lysis benadering. Eerst, L. monocytogenes geïnfecteerde macrofaag-cellen worden gelyseerd met koud water. Vervolgens worden macrofaag kernen verwijderd door een korte centrifugatie en intacte bacteriën snel verzameld op filter, waaruit RNA wordt geïsoleerd met behulp van hete fenol SDS-extractie van bacteriële nucleïnezuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol vormt een geoptimaliseerde methode voor de isolatie van bacteriële RNA uit L. monocytogenes bacteriën intracellulair groeien in macrofaagcellen. Dit protocol is gebaseerd op differentiële cel lysis en omvat twee belangrijke stappen voor de verrijking van bacteriële RNA: macrophage kernen sedimentatie middels centrifugatie en snelle ophoping van bacteriën door filtratie. Deze stappen worden gevolgd door een standaard RNA-extractieprocedure. Hoewel dit protocol beschrijft zuiverin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3’Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
