РНК Очистка от внутриклеточно Grown<em> листерий</em> В клетках макрофагальной
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Внутриклеточные бактериальные патогены ─ бактерии , вызывающие инфекционные заболевания и способны расти и воспроизводить внутри клеток человека хозяев ─ являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире 5. Для того, чтобы вторгнуться и размножаться внутри клетки млекопитающих, внутриклеточные патогены приобрели сложные механизмы вирулентности и факторы. В то время как эти механизмы имеют основополагающее значение для способности вызывать заболевание, мы мало знаем о их регуляции и динамики знают. Так как профили экспрессии генов бактерий, выращенных в жидких средах, не отражают реальную среду внутри клеток-хозяев, существует растущая потребность в транскриптома анализа бактерий, выращенных в их внутриклеточных ниш. Такой анализ позволит расшифровку специфических бактериальных адаптаций сработавших хозяином и поможет определить новые цели для терапевтического дизайна. Транскриптом анализ внутриклеточно выращенных бактерий является весьма сложной задачей, поскольку РНК млекопитающих превышает число бактерий РНК вкак минимум в десять раз. В этой рукописи мы опишем экспериментальный метод для выделения бактериальной РНК из листерий бактерий , растущих внутри мышиных клеток макрофагов. Извлеченный РНК может быть использован для изучения внутриклеточных адаптации и вирулентность механизмов патогенных бактерий с помощью различных методик анализа транскрипции, таких как RT-PCR, РНК-Seq, микрочипов и других гибридизацией на основе технологий.
L. моноцитогенес является возбудителем листериоза у людей, заболевание с клиническими проявлениями , ориентированных в первую очередь лица с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин 6. Это является грамположительных факультативным внутриклеточным патогеном , который вторгается широкий спектр клеток млекопитающих , которые были использованы на протяжении десятилетий в качестве модели в хозяин-патоген взаимодействий изучает 7. После вторжения, он находится первоначально в вакуоли или фагосому (в случае фагоцитирующих клеток), из которых он должен уйти в тон пройдет цитозоль клетки для репликации. Несколько факторов вирулентности было показано, опосредует процесс утечки, в первую очередь в качестве порообразующего гемолизин, Listeriolysin O (ДСО) и два дополнительных фосфолипаз 8. В цитоплазме бактерии используют хозяина машины полимеризации актина , чтобы продвинуть себя на актиновых филаментов внутри клетки и передается от клетки к клетке (Рисунок 1). Все основные факторы вирулентности L. моноцитогенес , участвующие в инвазии, внутриклеточного выживания и репликации, активируются с помощью регулятора транскрипции мастер вирулентности, PrfA. 8-10.
В последнее десятилетие было проведено несколько исследований , проведенных нами и другие успешно применяются методы транскриптом анализа внутриклеточно выращенных бактерий внутри клеток хозяина 2,11-15. Два основных подхода используются для разделения бактериальной РНК из хозяина-РНК, которые основаны на: 1) селективное обогащение бактериальной РНК и 2) выделения РНК по сиситемахrential лизис клеток. Первый подход основан на субтрактивном гибридизации общих экстрактов РНК молекулы РНК млекопитающих (например , с использованием коммерчески доступных наборов) или селективного захвата бактериальных последовательностей транскрибируемых (шотландцы) 11. Второй подход основан на дифференциальном лизис бактерий и клеток-хозяев, в котором клетки-хозяева лизируют в то время как бактериальные клетки остаются нетронутыми. Бактериальные клетки затем отделяют от клетки-хозяина лизата, как правило, путем центрифугирования, и РНК экстрагируют с использованием стандартных методик. Основная проблема с использованием этого подхода является то, что вместе с интактной бактерии, клетки-хозяева ядра также изолированы, таким образом, препараты РНК по-прежнему содержат РНК млекопитающих. Один из способов решения этой проблемы заключается в разделении неповрежденные бактерии из клеток хозяина, ядер с использованием дифференциального центрифугирования, хотя эта процедура обычно занимает много времени поднимая беспокойство изменений в гене профиля экспрессии в процессе экстракции. В этой статье мы представляем улучшенный и быстрый баПротокол экстракции cteria РНК, которая основана на клеточной дифференциального лизиса подхода. Во- первых, Л. моноцитогенес инфицированные макрофаги клетки лизируют с холодной водой. Затем макрофаг ядра удалены кратковременным центрифугированием и неповрежденные бактерии быстро собирают на фильтрах, из которых РНК выделяют с помощью горячей экстракции фенолом-SDS бактериальных нуклеиновых кислот.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол , описанный здесь , представляет собой оптимизированный способ выделения бактериальной РНК из L. моноцитогенес бактерии растущих внутриклеточно в клетках макрофагов. Этот протокол основан на лизисе клеток дифференциального и включает в себя два основных шага для обогащ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3’Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
