Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques
Summary
An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Abstract
L'objectif de ce protocole est de décrire les altérations moléculaires dans les cornées diabétiques humains et démontrer comment ils peuvent être atténués par la thérapie génique adénovirale dans cornées d'organes en culture. La maladie de la cornée diabétique est une complication du diabète avec des anomalies fréquentes des nerfs de la cornée et de la cicatrisation de l'épithélium. Nous avons également documenté l'expression modifiée de façon significative de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains. Pour pallier ces changements, la thérapie génique adénovirale a été réalisé avec succès en utilisant la régulation positive de c-met l'expression du proto-oncogène et / ou la régulation négative de la matrice de protéinases métalloprotéinase-10 (MMP-10) et de la cathepsine F. Cette thérapie a accéléré la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques même lorsque seul le compartiment des cellules souches limbiques a été transduite. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un traitement combiné. Pour la transplantation possible du patient des cellules souches normalisées, par exemple, est également présenté de l'optimizatisur la transduction de gènes dans des cultures enrichies de cellules souches en utilisant des amplificateurs polycationiques. Cette approche peut être utile non seulement pour les gènes sélectionnés, mais aussi pour les autres médiateurs de la cornée cicatrisation épithéliale et endiguer la fonction cellulaire.
Introduction
La maladie de la cornée diabétique résulte principalement dans l'épithélium dégénératif (kératopathie) et nerveux (neuropathie) changements. Il se manifeste souvent par les anomalies de la cicatrisation des plaies épithéliales et la cornée réduction du nerf 1-4. On estime que 60-70% des diabétiques ont divers problèmes de la cornée 1,3. Nos études ont identifié plusieurs protéines de marquage avec une expression altérée dans les cornées diabétiques humains , y compris la régulation négative de (récepteur du facteur de croissance des hépatocytes) proto-oncogène c-met et la régulation positive de la métalloprotéinase matricielle 10 (MMP-10) et de la cathepsine F 5, 6. nous avons aussi documenté diminué de manière significative l'expression de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains.
Dans les études précédentes, nous avons mis au point une thérapie génique à base adénovirale pour normaliser les niveaux des marqueurs du diabète altéré en utilisant le système humain diabétique de cornée de culture d'organe, ce qui montre une cicatrisation lente des plaies, diabétiquechangements de position, et la tige marqueur cellulaire réduction d'expression similaire aux ex vivo cornées 7,8. Cette persistance des variations semble être due à l'existence de la mémoire métabolique 9 épigénétique. Ce système de culture a été en outre utilisé pour la thérapie génique. Les objectifs de cette thérapie ont été choisis parmi les marqueurs avec soit une expression réduite dans les cornées diabétiques (c-met proto-oncogène), ou une augmentation de l' expression (MMP-10 et de la cathepsine F).
Le (AV) la thérapie adénovirale a été utilisé dans les cornées d'organes en culture entiers ou le compartiment limbique périphérique cornéo seulement. Ce compartiment abrite les cellules souches épithéliales qui renouvellent l'épithélium cornéen et participent activement à la cicatrisation des plaies 4,10-15. Ici, les protocoles sont prévus pour la culture normale de la cornée humaine diabétique organe, la cicatrisation des plaies epitheliales, l'isolement et la caractérisation des cultures cellulaires limbique enrichis en cellules souches et de cellules et la transduction adénovirale de la cornée. notreles résultats montrent la faisabilité de cette thérapie pour normaliser l'expression du marqueur et la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques pour une éventuelle transplantation future. Ils suggèrent également que la thérapie de combinaison est le moyen le plus efficace pour restaurer motif marqueur normal et la guérison épithéliales de la cornée diabétique 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cornée semble être un tissu idéal pour la thérapie génique en raison de son emplacement de surface où la livraison de gènes, ainsi que l'évaluation de l'efficacité et les effets secondaires, sont faciles. Toutefois, une traduction clinique de cette approche puissante est encore lente en raison de peu d' informations sur les causes génétiques des maladies de la cornée et les cibles de thérapie génique 24. Les complications diabétiques , y compris des modifications de la cornée pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
Materials
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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