Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal
Summary
An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Abstract
El objetivo de este protocolo es describir las alteraciones moleculares en las córneas diabéticos humanos y demostrar cómo pueden ser aliviados mediante terapia génica adenoviral en córneas cultivadas de órganos. La enfermedad de la córnea diabética es una complicación de la diabetes con anomalías frecuentes de los nervios corneales y la curación de heridas epiteliales. También hemos documentado la expresión alterada de manera significativa de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en córneas humanas diabéticos. Para aliviar estos cambios, la terapia génica adenoviral se aplicó con éxito el uso de la regulación al alza de la expresión de proto-oncogén c-met y / o la regulación a la baja de la matriz metaloproteinasa-proteinasas 10 (MMP-10) y la catepsina F. Esta terapia acelerado la cicatrización de heridas en diabéticos córneas incluso cuando fue transducida sólo el compartimento de células madre del limbo. Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento combinado. Para el trasplante posible paciente de las células madre normalizadas, un ejemplo se presenta también de la optimizatien la transducción de genes en cultivos enriquecidos con células madre utilizando potenciadores policatiónicos. Este enfoque puede ser útil no sólo para los genes seleccionados, sino también para los otros mediadores de la cicatrización de la herida corneal epitelial y la función de células madre.
Introduction
La enfermedad de la córnea diabética se debe principalmente en el epitelio degenerativa (queratopatía) y cambios nerviosas (neuropatía). A menudo se manifiesta por las alteraciones de la cicatrización de heridas del epitelio y la reducción de nervio corneal 1-4. Se estima que 60-70% diabéticos tienen diversos problemas corneales 1,3. Nuestros estudios han identificado varias proteínas marcadoras con expresión alterada en las córneas diabéticos humanos, incluida la regulación a la baja de los proto-oncogén (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) c-met y la regulación al alza de la metaloproteinasa de matriz 10 (MMP-10) y la catepsina F 5, 6. también hemos documentado de manera significativa disminución de la expresión de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en las córneas diabéticos humanos.
En los estudios anteriores hemos desarrollado una terapia génica basada en adenoviral para normalizar los niveles de marcadores de la diabetes alterado utilizando el sistema de la córnea diabética humana de cultivo de órganos, que muestra lenta la cicatrización de heridas, diabéticocambios de marcador, y la reducción de la expresión de marcadores de células similares a las córneas ex vivo 7,8 tallo. Esta persistencia de los cambios parece ser debido a la existencia de memoria metabólica epigenética 9. Este sistema de cultivo era más utilizados para la terapia génica. Los objetivos para esta terapia se eligieron a partir de marcadores, ya sea con una expresión reducida en córneas diabéticos (c-met proto-oncogén), o aumento de la expresión (MMP-10 y la catepsina F).
La terapia adenoviral (AV) se utilizó en todo el córneas de órganos-cultivadas o sólo la corneoscleral compartimento limbal periférica. Este compartimiento alberga las células madre epiteliales que renuevan el epitelio corneal y participan activamente en la curación de heridas 4,10-15. Aquí, se proporcionan protocolos para el cultivo normal y diabética humana corneal de órganos, la cicatrización de heridas del epitelio, el aislamiento y la caracterización de los cultivos celulares limbal enriquecida de células madre, y células adenoviral y la transducción de la córnea. Nuestraresultados demuestran la factibilidad de este tratamiento para la normalización de la expresión del marcador y la cicatrización de heridas en diabéticos córneas para trasplante posible futuro. También sugieren que la terapia de combinación es la forma más eficaz para restaurar patrón marcador normal y la curación epitelial en la córnea diabética 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
La córnea parece ser un tejido ideal para la terapia génica debido a su ubicación superficie en la que la entrega de genes, así como la evaluación de la eficacia y efectos secundarios, son fáciles. Sin embargo, una traducción clínica de este enfoque poderoso sigue siendo lento debido a la escasa información sobre las causas genéticas de las enfermedades de la córnea y los objetivos de terapia génica 24. Complicaciones diabéticas, incluyendo alteraciones de la córnea pueden ser en gran parte epig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
Materials
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
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