Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
Der Thymus ist die primäre lymphoiden Organ für die Erzeugung einer vielfältigen Population von pathogen-reaktives, selbst tolerant T-Zellen, die für die Funktion des erworbenen Immunsystems wesentlich ist. Es ist ein dynamisches Organ, in dem die Entwicklung Thymozyten aus dem Knochenmark als Lymphozyten-Vorläuferzellen immigrierte, wandern durch die schwammartige dreidimensionale (3-D) Matrix des Thymus-Stroma, durchlaufen abstammungs Spezifizierung und Differenzierung, und schließlich auswandern als reifen T-Zellen. Der Erfolg dieses gut programmiert Verfahren hängt weitgehend von der Kreuzkopplung zwischen den wandernden Thymozyten und den Wohn Thymus-Epithelzellen (TECs), die vorherrschende Bevölkerung des Thymus-Stroma, die für die Einrichtung und Aufrechterhaltung der Integrität des Thymus Mikroumgebung wesentlich sind.
Auf der Grundlage ihrer anatomischen Lage und einzigartige Funktion kann TECs in zwei Untergruppen unterteilt werden: die TECs in der Hirnrinde (CTEC), die Verant sindwortlich Selbst MHC (Major Histocompatibility Complex) beschränkt T-Zellen (positive Auswahl) und die TECs in der Medulla (mTEZ) , die zur Eliminierung autoreaktiver T-Zellen wesentlich sind (negative Selektion) 1,2 für die Auswahl. Viele Faktoren (zB Alterung, Infektion, Bestrahlung, medikamentöse Behandlungen) können irreversible Schäden an der Thymus – Epithel führen, in kompromittierten adaptive Immunität führt. Trotz zahlreicher Versuche hat die Thymusfunktion Wiederherstellung herausfordernd aufgrund der Schwierigkeit, den Thymus-Mikroumgebung zu reproduzieren. Bemerkenswerterweise ist thymic dreidimensionale (3-D) -Konfiguration entscheidend für das Überleben und die Funktion von TECs, während TECs kultiviert in einem 2-D – Umgebung schnell die Expression von Genen kritisch für Thymopoese 3,4 verringern.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) und dessen C-terminale histidinylated analogen EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sind niedermolekulare, amphiphile Oligopeptide, die in deionisiertem gegen Ende der löslichenr, sondern gehen Gelieren β-Fibrillen zu bilden, wenn sie Ionenstärke von mehr als 20 mM NaCl (normale Salzkonzentration in der menschlichen Körperflüssigkeit beträgt 154 mM) ausgesetzt. Diese Umwelt reagierende Eigenschaft macht sie vielseitige Bausteine 3D-Strukturen zu bilden. Das His-Tag auf EAKII-H6 ein Andockmechanismus, durch welche die anti-His IgGs / Fc-bindenden rekombinantes Protein A / G (αH6: pA / G) -Komplexen als Adapter dienen können Proteinwirkstoffen und anderen Biomolekülen zu verankern ( zB Antikörper) auf dem Hydrogelverbundstoff 5-8.
Wir haben zuvor gezeigt , daß 9 bis zu 13 Tage an der Injektionsstelle fluoreszenzmarkierte IgG – Moleküle auf dem Hydrogel verankert können beibehalten werden. Wenn ferner die αH6: pA / G Adapter verankert mit anti-CD4 IgGs an das Hydrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hinzugefügt wurden, wurden CD4 + T – Zellen spezifisch 10 eingefangen. Unter Verwendung ähnlicher Technik haben wir vor kurzem gezeigt, dass 3-D-Aggregation von TECs c(: PA / G: αEpCAM αH6) Ould mit Adapter Komplexe tragen TEC-spezifische anti-EpCAM-Antikörper in EAK Hydrogel gefördert werden. Wenn unterhalb der Nierenkapseln von nackten Mäusen transplantiert, können die TEC – Cluster in EAK Hydrogel eingebettet effektiv die Entwicklung von funktionellen T – Zellen in vivo 11,12 unterstützen.
Hier veranschaulichen wir unser Verfahren, um schnell und effektiv reinigen TECs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und Erzeugen 3-D TEC Aggregate mit dem EAK Hydrogelsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während TECs die vorherrschende Bevölkerung der Thymus-Stroma und spielen eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion der Thymusdrüse sind, repräsentieren sie nur etwa 0,1-0,5% des gesamten Thymus Zellularität. Sie sind auch zerbrechlich Zellen als hohe Anteile an Zelltod werden gelegentlich folgenden Kollagenaseverdau beobachtet, dh die Behandlung TECs aus der extrazellulären Matrix (ECM) zu dissoziieren. Ihre Seltenheit (~ 200.000 pro Maus Thymus) und Zerbrechlichkeit machte es eine anspruch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health gewährt R21 AI113000 (WSM) und R01 AI123392 (YF) unterstützt.
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
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