Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine humaine et sont rapidement recrutés pour des sites inflammatoires. Amorçage est un événement critique qui améliore la fonctionnalité phagocytaire des neutrophiles. Bien que des études approfondies ont dévoilé l'existence et l' importance de neutrophiles amorçage lors de l' infection et des blessures, des moyens de visualisation de ce processus in vivo ont été indisponibles. Le protocole fourni permet de surveiller le processus dynamique de neutrophiles amorçage chez les animaux vivant en combinant trois méthodes: 1) Signal rapporteur DsRed – utilisé comme une mesure d'amorçage 2) in vivo étiquetage des neutrophiles – réalisé par injection de l' antigène anti-lymphocyte fluorescence conjugué 6G (Ly6G) anticorps monoclonal (mAb) et 3) l'imagerie confocale intravitale. Plusieurs étapes critiques sont impliqués dans ce protocole: la souris inflammation induite par l'oxazolone-cutanée de l'oreille, la sédation appropriée des animaux, des injections répétées de mAb anti-Ly6G et prevention de la dérive de mise au point lors de l'imagerie. Bien que quelques limitations ont été observées, telles que la limite de temps d'imagerie continue (~ 8 h) chez une souris et la fuite de l'isothiocyanate de fluorescéine-dextran de vaisseaux sanguins dans l'état inflammatoire, ce protocole fournit un cadre fondamental pour l'imagerie intravitale de le comportement apprêté neutrophile et la fonction, qui peut être facilement étendu à l'examen d'autres cellules immunitaires dans les modèles d'inflammation de la souris.
Introduction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants et de courte durée en circulation. Ils sont rapidement recrutés pour les sites d'infection ou d'une blessure, où ils servent phagocytes comme professionnels par la libération d'oxygène et d' azote intermédiaires réactifs ainsi que des granulés contenant des peptides et des protéases 1 antimicrobiens. Au cours de leur recrutement, les neutrophiles sont "apprêtées" par divers agents , y compris les produits microbiens, chemoattractants et cytokines inflammatoires, entraînant nettement amélioré la fonctionnalité phagocytaire arrivée à un site d'inflammation 2. Les mécanismes d'amorçage de neutrophiles ont été étudiés in vitro 3,4; Toutefois, le suivi dynamique du processus in vivo n'a pas été possible à ce jour.
Récemment, l'imagerie intravitale est devenue une technique importante pour la visualisation et la quantification de la dynamique cellulaire des processus biologiques dans les organismes vivants. Intraviimagerie tal peut être réalisée par excitation au microscope un photon classique (par exemple, confocale) ou des approches microscopie multiphotonique 5. Au fil du temps, des améliorations substantielles ont été réalisées dans cette technique permettant une meilleure résolution d'image, l' amélioration de la profondeur d'imagerie, une diminution de photovieillissement de tissu, et le renforcement de 6,7 de stabilisation d'image. Compte tenu de sa capacité unique de permettre une visualisation dynamique de la migration cellulaire et l' interaction au fil du temps, la microscopie intravitale a été largement appliquée à divers domaines d'études en immunologie 8. imagerie intravitale permet immunologistes de mieux comprendre et contextualiser les réponses immunitaires à la fois au niveau cellulaire et moléculaire dans la vie des modèles animaux.
Des progrès récents dans transgéniques ainsi que des souris knock-in rapporteuses ont fourni des outils utiles pour la surveillance des comportements dynamiques des neutrophiles chez les animaux vivants. Lysozyme M promoteur-driven améliorée protéine fluorescente verte knock-inles souris ont été largement utilisés pour caractériser la motilité des neutrophiles, des monocytes et des macrophages au cours de divers processus inflammatoires comprenant une extravasation, une infection bactérienne, une inflammation stérile et 9-15. En outre, des souris transgéniques exprimant une résonance de fluorescence cytoplasmique de transfert d'énergie biocapteur ont été utilisés dans l' étude de l'activité des neutrophiles mitogene kinase extracellulaire régulée et la protéine kinase A l' intérieur de l' intestin enflammées 16. Un modèle de souris avec une spécificité élevée pour l' expression de la fluorescence dans des neutrophiles est la souris knock-in Catchup, qui produit la recombinase Cre, ainsi que la tdTomato protéine fluorescente, qui est lui – même couplé à l' expression de l' antigène des lymphocytes 6G (Ly6G) 17. Visualisation des neutrophiles Ly6G déficientes par ce modèle a montré que ces cellules exercent une fonctionnalité normale dans une variété de contextes in vivo inflammatoires stériles ou infectieuses. Des souris transgéniques exprimant la DsRed fluorescente protein gène sous le contrôle de la souris interleuikin-1β (IL-1β), le promoteur (pIL1-DsRed) ont été utilisés pour visualiser les comportements motiles de cellules produisant de l'IL-1 ß – censé inclure les neutrophiles, les monocytes inflammatoires et des macrophages activés – émergents dans la peau enflammée 18.
In vivo l' étiquetage peut servir comme une approche alternative pour tracer les comportements cellulaires et moléculaires de neutrophiles dans les tissus enflammés. Après injection intraveineuse de faibles doses de fluorescence anticorps anti Gr-1-anticorps monoclonal (mAb), la cascade de recrutement de Gr-1 + neutrophiles a été visualisées dans des lésions de la peau de souris infectées par Staphylococcus aureus 19. L' administration in vivo des conjugués contenant de la streptavidine conjugués 705 points quantiques nm et biotinylé anti-Ly6G mAb étiqueter spécifiquement neutrophiles circulants 20. En outre, l'endocytose de ces conjugués dans neutrophvésicules IL permet le suivi du transport vésiculaire à grande vitesse dans les neutrophiles qui migrent dans le tissu interstitiel. In vivo , le marquage avec des anticorps fluorescents conjugués contre la P-sélectine glycoprotéine ligand-1 (PSGL-1), L-sélectine (CD62L), l' intégrine aM (CD11b ) et chimiokines (CXC motif) récepteur 2 (CXCR2) dans un modèle inflammatoire induite par le TNFa a élucidé les mécanismes de régulation en jeu lors de l' inflammation précoce 21. polarisants neutrophiles font saillie uropodes PSGL-1-enrichi à interagir avec CD62L présent sur les plaquettes activées, ce qui entraîne une redistribution des CD11b et CXCR2, des récepteurs qui stimulent la migration des neutrophiles et déclenchent l'inflammation.
IL-1β est l' un des gènes de signature qui est élevée dans les 22 neutrophiles amorcées. Chez les souris rapporteurs pIL1-DsRed, des signaux de fluorescence DsRed (ie., L' activation du promoteur IL-1β) une corrélation positive avec l' IL-1β expression de l' ARNm et de la production de la protéine IL-1β. <sup> 18 Pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage, une méthode de microscopie intravitale a été développé impliquant l' induction de l' inflammation de la peau avec oxazolone (OX) dans le modèle de la souris pIL1-DsRed après marquage in vivo des neutrophiles avec fluorescence conjugué anti-Ly6G mAb. À travers ce modèle, il est possible d'étudier le comportement et la fonction des neutrophiles amorcées dans des modèles animaux de diverses maladies et affections.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de cette étude est de développer une technologie pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage chez les animaux vivants, qui n'a pas encore été remplies par les techniques actuellement disponibles. Pour atteindre cet objectif, trois méthodes établies sont exécutées: 1) l' induction d' une inflammation cutanée chez des souris IL-1 ß reporter DsRed promoteur-driven comme une mesure de l' amorçage, 2) marquage in vivo des neutrophiles avec de faibles doses de fluorescence…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
