Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sequenciação e estudos de genotipagem baseados, incluindo Estudos do Genoma-Wide Association (GWAS), estudos locus candidato, e deep-sequenciação estudos, identificamos muitas variantes genéticas que estão estatisticamente associados com uma doença, característica ou fenótipo. Ao contrário do que as previsões iniciais, a maior parte destas variantes (85-93%) estão localizados em regiões não codificantes e não alteram a sequência de aminoácidos de proteínas de ^1,2. Interpretando a função destas variantes não-codificantes e determinar os mecanismos biológicos que ligam-los para a doença associada, traço, ou fenótipo provou desafiador ^3-6. Nós desenvolvemos uma estratégia geral para identificar os mecanismos moleculares que ligam variantes para um importante intermediário fenótipo – a expressão do gene. Esse gasoduto é projetado especificamente para identificar a modulação da ligação de variantes genéticas TF. Esta estratégia combina abordagens computacionais e técnicas de biologia molecular voltadas para preverefeitos biológicos das variantes candidatos in silico e verifique estas previsões empiricamente (Figura 1).

Figura 1:.. Uma abordagem estratégica para a análise de Passos não-codificantes variantes genéticas que não estão incluídos no protocolo detalhado associado a este manuscrito estão com fundo cinza Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em muitos casos, é importante começar pela expansão da lista de variantes para incluir todos aqueles em alta linkage-desequilíbrio (LD), com cada variante estatisticamente associada. LD é uma medida da associação não aleatória de alelos em duas posições cromossómica diferente, o que pode ser medido pela estatística de R ^{2 7. R2} é uma medida da linkage desequilíbrio entre duas variantes, com um r ² = 1 denotando ligação perfeita entre duas variantes. Os alelos em alta LD são encontrados a co-segregar no cromossoma através de populações ancestrais. matrizes de genotipagem circulante não inclui todas as variantes conhecidas do genoma humano. Em vez disso, eles explorar o LD dentro do genoma humano e incluem um subconjunto das variantes conhecidas que funcionam como proxies para outras variantes dentro de uma região particular de LD ^8. Assim, uma variante sem qualquer consequência biológica pode estar associada com uma doença em particular, porque é em LD com a variante a-causal variante com um efeito biológico significativo. Processualmente, recomenda-se para converter a versão mais recente dos 1.000 genomas projetar ⁹ arquivos de chamada variante (VCF) em arquivos binários compatíveis com Plink ^10,11, uma ferramenta de código aberto para análise de associação do genoma inteiro. Posteriormente, todas as outras variantes genéticas com LD r ^2> 0,8 com cada va genética de entradaRiant podem ser identificados como candidatos. É importante usar a população de referência apropriado para este passo-por exemplo, se uma variante foi identificada em indivíduos de ascendência europeia, dados de indivíduos de ascendência similar deve ser usado para a expansão LD.

LD expansão muitas vezes resulta em dezenas de variantes de candidatos, e é provável que apenas uma pequena fracção delas contribuir para mecanismo da doença. Muitas vezes, isto não é exequível para examinar experimentalmente cada uma destas variantes individualmente. Portanto, é útil para alavancar os milhares de conjuntos de dados genômicos funcionais publicamente disponíveis como um filtro para priorizar as variantes. Por exemplo, o consórcio CODIFICAR ¹² realizou milhares de experiências Chip-seguintes que descrevem a ligação de TF e co-factores, e marcas de histona numa vasta variedade de contextos, juntamente com os dados de acessibilidade cromatina de tecnologias tais como a DNase-SEQ ^13, ATAC -seq ¹⁴ e FAIRE-seq ^15. databases e servidores web, tais como o navegador UCSC Genome ^16, Roteiro Epigenomics ^17, Blueprint Epigenome ^18, Cistrome ^19, e remapear ²⁰ permitem o acesso gratuito aos dados produzidos por essas e outras técnicas experimentais através de uma ampla gama de tipos e condições celulares. Quando existem muitas variantes para examinar experimentalmente, estes dados podem ser utilizadas para hierarquizar os localizados dentro das regiões reguladoras prováveis ​​em tipos de células e de tecidos relevantes. Além disso, nos casos em que uma variante está dentro de um pico ChIP-seq para uma proteína específica, esses dados podem fornecer potenciais clientes em potencial quanto à TF específico (s) ou co-fatores cuja ligação pode estar afetando.

Em seguida, as variantes resultantes priorizadas são testadas experimentalmente para validar proteína dependente do genótipo previu ligação usando EMSA ^21,22. EMSA mede a mudança na migração do oligo num gel de TBE não redutoras. oligo marcado com fluorescência é incubada com olisado nuclear, e ligação de factores nucleares irá retardar o movimento do oligo no gel. Desta maneira, oligo que se tenha ligado mais factores nucleares vai apresentar-se como um sinal de fluorescência mais forte sobre a digitalização. Notavelmente, a EMSA não requer previsões sobre as proteínas específicas cuja ligação será afetado.

Uma vez que as variantes são identificados que estão localizados dentro das regiões reguladoras previstos e são capazes de factores nucleares de ligação diferencialmente, métodos computacionais são utilizados para prever o TF específico (s) cuja ligação que possa afectar. Nós preferimos usar CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UNIProbe ^26, e Jaspar ^27. Uma vez candidato TFs são identificados, essas previsões podem ser testados especificamente utilizando anticorpos contra esses TFs (EMSA-supershifts e DAPA-Westerns). Um EMSA-supershift envolve a adição de um anticorpo específico para o TF ao lisado nuclear e oligo. Um resultado positivo em um EMSA-supershift é represented como mais um desvio na banda de EMSA, ou uma perda da banda (revisto em referência ^28). No DAPA complementar, uma cadeia dupla oligo 5'-biotinilado contendo a variante e a 20 pares de bases que flanqueia nucleótidos são incubadas com lisado nuclear do tipo de célula relevante (s) para capturar quaisquer factores nucleares que se ligam especificamente os oligos. O complexo do factor nuclear-duplex oligonucleótido é imobilizado por estreptavidina micropérolas em uma coluna magnética. Os fatores nucleares ligados são recolhidos directamente através de eluição ^29,48. previsões de ligação pode então ser avaliada por uma transferência de Western utilizando anticorpos específicos para a proteína. Nos casos em que não existem previsões óbvias, ou muitas previsões, as eluições de variantes menus pendentes dos experimentos DAPA podem ser enviadas para um núcleo de proteômica para identificar TFs candidatos usando espectrometria de massa, que podem posteriormente ser validados usando estes previamente descrito métodos.

No restante do articlE, o protocolo detalhado para análise EMSA e DAPA de variantes genéticas é fornecido.

Protocol

1. Preparação de soluções e Reagentes Encomendar sondas de oligonucleotídeos de DNA personalizados para uso em EMSA e DAPA. Para reduzir a proteína de ligação não específica, conceber oligonucleótidos curtos (entre 35-45 pares de bases (pb) de comprimento) 30, e colocar a variante de interesse directamente no centro flanqueado por sua sequência genómica endógena de 17 pb. Para oligos EMSA, adicione um 'fluoróforo 5. Para oligos DAPA, adicionar uma marca 5 'biotina. <…

Representative Results

Nesta seção, os resultados representativos do que esperar são fornecidos ao executar uma EMSA ou DAPA, ea variabilidade no que diz respeito à qualidade do ligado é caracterizado. Por exemplo, tem sido sugerido que a congelação e descongelação de amostras de proteína várias vezes pode resultar na desnaturação. A fim de explorar a reprodutibilidade das análises EMSA no contexto destes ciclos de "congelamento-descongelamento", dois 35 oligos bp que diferem em uma var…

Discussion

Apesar de avanços em tecnologias de sequenciamento e genotipagem tem bastante reforçada a nossa capacidade para identificar variantes genéticas associadas à doença, a nossa capacidade de compreender os mecanismos funcionais impactados por estas variantes está atrasado. Uma das principais fontes do problema é que muitas variantes associados à doença estão localizados em n-codificante em regiões do genoma, que provavelmente afectam mais difícil de prever mecanismos que controlam a expressão do gene. Aqu…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES