Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Summary

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (T_reg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the T_reg cells.

Abstract

Regulatory T (T _reg) Zellen, die Foxp3 als Transkriptionsfaktor exprimieren, sind Untergruppen von CD4 ⁺ T – Zellen. T _reg – Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immuntoleranz und Homöostase Wartung durch die Immunantwort regulieren. Die primäre Rolle der T _reg Zellen ist , die Proliferation von Effektor – T (T _eff) Zellen und die Produktion von Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α und IL-2 zu unterdrücken. Es wurde gezeigt , dass T _reg Zellen die Fähigkeit , die Funktion von T – Zellen zu hemmen _eff während persistent Pathogen – Infektion und der Entwicklung von Krebs verbessert. Um die Funktion von T _reg Zellen unter ruhenden oder entzündeten Bedingungen, die eine Vielzahl von in – vitro – Unterdrückung Tests unter Verwendung von Maus oder humanen T – _reg – Zellen klären entwickelt worden. Das Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zu entwickeln , um die Unterschiede im Phänotyp und unterdrückende Funktion zwischen ruhenden und aktivierten T _reg zu vergleichenZellen. Um aktivierten T – _reg – Zellen wurden die Mäuse infiziert mit lymphatischer choriomeningitis Virus (LCMV) Klon 13 (CL13), eine chronische Belastung von LCMV isolieren. T _reg Zellen aus der Milz von LCMV CL13-infizierten Mäusen isoliert zeigten sowohl die aktivierten Phänotyp und verbesserte suppressive Aktivität gegenüber T – Zellen aus naiven _reg Mäusen isoliert ruht. Hier beschreiben wir die Basisprotokoll für ex vivo – Phänotyp – Analyse aktivierten T – _reg – Zellen unterscheiden von T _reg ruhenden Zellen. Weiterhin beschreiben wir ein Protokoll für die Messung der suppressive Aktivität von vollständig aktivierten T _reg Zellen.

Introduction

Regulatorische T (T _reg) Zellen exprimieren forkhead box P3 (Foxp3) als Transkriptionsfaktor für ihre Entwicklung und Funktion ^1. Zusätzlich exprimieren T _reg Zellen verschiedene andere Moleküle wie CD25 ^2, Lymphozytenaktivierung Gen 3 (LAG-3) ^3, Glucocorticoid-induzierter Tumor necrosis factor receptor ⁴ und zytotoxische T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) ⁵ auf ihrer Oberfläche oder intrazelluläre Region. Während einer chronischen Infektion mit verschiedenen Arten von Krankheitserregern wie Viren ^6,7, Bakterien ^8,9 und Parasiten ^10-12, oder im Verlauf der Krebsentwicklung ^13,14 geworden T _reg Zellen in aktivierten Zellen differenziert, verbesserte Unterdrückungsfunktion anzeigt Targeting – Effektor CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T – Zellen. Eine Reihe von Arbeiten haben vorgeschlagen , dass erweitert und aktivierten T – _reg – Zellen auf die Beeinträchtigung der CD8 ⁺ T – Zell – respons beitragene während Freund Retrovirus (FV) Infektion ^15-17. FV-induzierte T – Zellen hemmen _reg IFN-γ oder Granzym B Expression und zytotoxische Reaktivität von CD8 ⁺ T – Zellen ^15-17. Darüber hinaus wurde in einem Herpes simplex – Virus – Infektionsmodell berichtet geführt , die Depletion von CD4 ⁺ CD25 ⁺ T – Zellen in _reg Expansion der virusspezifischen CD8 ⁺ T – Zellen und schwere Gewebeschäden durch Infiltration von immunopathogenen CD4 ⁺ T – Zellen ^18-20.

Mäuse chronisch mit dem 13 – Stamm von lymphatischer choriomeningitis Virusklon infiziert (LCMV CL13) ^21-24 haben den Phänotyp und die Funktion der Effektor – T – Zellen (T _eff) und T _reg Zellen während der chronischen Virusinfektion weit verbreitet zu charakterisieren. Während persistent LCMV – Infektion, Virus-spezifischen T – Zellen _eff schrittweise ihre Effektor – Funktion verlieren und erschöpft T (T _exh) Zellen werden. Auf der anderen Seite, T_reg Zellen verstärken ihre Fähigkeit , ²⁵ Virus-spezifischen T – Zell – Antwort zu unterdrücken. Die Abnahme der Funktionsfähigkeit der T _eff Zellen kann durch verschiedene Faktoren wie Aufregulation von inhibitorischen Rezeptoren auf T _eff Zellen veränderte Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen, die Herstellung von immunregulatorischen Zytokine und erhöhter Frequenz oder verstärkte Funktion von T _reg erklärt Zellen ^26. Unter den Faktoren , die bei T – Zell – Unterdrückung, den programmierten Zelltod – Protein-1 (PD-1) exprimierenden T _exh Zellen und T – _reg – Zellen wurden als Kennzeichen der Antigen Persistenz und unterdrückende Umwelt weit betrachtet. Vor kurzem wurde berichtet , dass die Blockade des PD-1 – Weg und Ablation von T _reg Zellen verbesserte T – Zell – Funktion führen und Viruslast während LCMV chronischen Infektion ²⁷ verringert. Darüber hinaus werden T _reg Zellen während einer chronischen Infektion von Mäusen mit LCMV aktiviert ^23,25 </sup> und ihre unterdrückende Funktion ²⁵ verstärkt. PD-1 ist stark auf T – Zellen exprimiert _reg sowie T _exh Zellen und der Grad der PD-1 durch T – Zellen exprimiert _reg korreliert mit der Stärke ihrer suppressive Funktion T – Zell – Proliferation ²⁵ zu hemmen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren mit den Merkmalen von aktivierten T – _reg – Zellen von Mäusen , infiziert mit LCMV CL13 und ruhenden T _reg Zellen isoliert aus naiven Mäusen isoliert zu vergleichen. Weiterhin erläutern wir eine Reihe von Prozessen aktiviert T _reg Zellen zu trennen und ihre ex vivo Phänotyp zu untersuchen, sowie ihre suppressive Aktivität in vitro zu messen.

Protocol

In dieser Studie wurden die Mäuse in einem spezifischen Pathogen freie Einrichtung des Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University gehalten. mit von der International genehmigten Protokollen Animal Care und Use Committee des Yonsei Laboratory Animal Research Center an der Yonsei University Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den koreanischen Food and Drug Administration Richtlinien durchgeführt. 1. Herstellung der Lösungen Bereiten 2% RPMI-Medium …

Representative Results

Wir erzeugten Mäuse mit persistenten Virusinfektion , indem sie mit 2 × 10 6 pfu von LCMV CL13 intravenös injiziert wird . Um die phänotypische Veränderungen in T reg Zellen und T conv Zellen während der chronischen Virusinfektion, Milzlymphozyten erhalten von naiven und infizierten Mäusen wurden gefärbt mit verschiedenen Antikörpern und analysiert mittels Durchflusszytometrie untersucht. CD4 + T conv (1A, o…

Discussion

Obwohl nur eine kleine Anzahl von T _reg Zellen in Mäusen und Menschen vorhanden sind , ist es wichtig , ihre Funktion zu verstehen , wie sie die Immunantwort bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der Immuntoleranz eine wichtige Rolle spielen. Die Anzahl und die unterdrückenden Funktionen von T _reg Zellen erhöht sich während einer chronischen Virusinfektion ^15-20 sowie Krebsprogression ^13,14. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der fortgesetzten Antigen-Stimulation. Zur Au…

Materials

FITC Rat Anti-Mouse CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714	Use this reagent for cell surface staining.
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
Fixation buffer		BD Biosciences	554655	Use this reagent for cell surface staining.
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cell strainer, 70mm		BD Biosciences	352350	Use this strainer for grinding the whole spleen.
Cell strainer, 40mm		BD Biosciences	352340	Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1X)		GE Life Sciences	SH30256
ACK Lysing Buffer		Gibco	A10492-01
L-Glutamine, 200mM solution		Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit		Life technologies	L-34975	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns		Miltenyibiotec	130-042-901	Use this column for Treg cell isolation
MACS Separation Columns, LS columns		Miltenyibiotec	130-042-401	Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation
EDTA, 0.5M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
Fetal Bovine Serum		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II flowcytometer		BD Biosciences		Flow cytometer*
Flowjo		TreeStar		Flow cytometry software†
Hematocytomer		Marienfeld superior