JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Published: June 22, 2016
doi:
10.3791/54138
, ,
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology,Yonsei University

Summary

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Abstract

Regulatoire T (T reg) cellen, die Foxp3 expressie als een transcriptiefactor, zijn subsets van CD4 + T-cellen. T reg cellen spelen een cruciale rol bij immuun tolerantie en homeostase onderhoud door het reguleren van de immuunrespons. De primaire rol van T reg cellen de proliferatie van effector T (T eff) cellen en de productie van cytokinen zoals IFN-γ, TNF-α en IL-2 te onderdrukken. Het is aangetoond dat het vermogen van T-cellen reg om de functie van T-cellen te remmen eff wordt versterkt bij persistente pathogeeninfectie en kankerontwikkeling. Om de functie van T-cellen reg grond rusten of ontstoken, kunnen er diverse in vitro onderdrukking assays met muis of humane T-cellen reg bedacht verduidelijken. Het belangrijkste doel van deze studie is om een methode om de verschillen in fenotype en onderdrukkende functie tussen rustende en geactiveerde T-reg te vergelijken ontwikkelencellen. Aan geactiveerde T-cellen reg isoleren, werden de muizen geïnfecteerd met lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV) kloon 13 (CL13), een chronische stam van LCMV. Reg T cellen geisoleerd uit de milt van LCMV CL13-geïnfecteerde muizen vertoonden zowel de geactiveerde fenotype en verbeterde onderdrukkende activiteit in vergelijking met rustende T cellen reg geïsoleerd uit naïeve muizen. Hier beschrijven we de basisprotocol voor ex vivo fenotype analyse geactiveerde T-cellen reg onderscheiden van rustende T-cellen reg. Verder beschrijven we een protocol voor het meten van de onderdrukkende activiteit van volledig geactiveerde T-cellen reg.

Introduction

Regulatoire T (T reg) cellen brengen forkhead box P3 (Foxp3) als een transcriptiefactor voor hun ontwikkeling en werking 1. Bovendien T reg cellen brengen verschillende andere moleculen zoals CD25 2, lymfocyt-activering gen 3 (LAG-3) 3, glucocorticosteroïde tumor necrosis factor receptor 4 en cytotoxische-T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (CTLA-4) 5 op hun oppervlak of intracellulaire gebied. Tijdens chronische infectie met verschillende soorten ziekteverwekkers zoals virussen 6,7, 8,9 bacteriën en parasieten 10-12 of tijdens kankerontwikkeling 13,14, raken T reg cellen gedifferentieerd in geactiveerde cellen en vertoont verbeterde onderdrukkende functie targeting effector CD4 + en CD8 + T-cellen. Een aantal artikelen hebben gesuggereerd dat uitgebreid en geactiveerde T-cellen reg bijdragen tot verminderde CD8 + T cel response tijdens vriend retrovirus (FV) infectie 15-17. FV-geïnduceerde T reg cellen te remmen IFN-γ of granzyme B expressie en reactiviteit van cytotoxische CD8 + T-cellen 15-17. Bovendien, in een herpes simplex virus-model, werd gemeld dat depletie van CD4 + CD25 + T cellen reg resulteerde in het vergroten van virus-specifieke CD8 + T-cellen en ernstige weefselschade door infiltratie van immunopathogene CD4 + T-cellen 18-20.

Muizen chronisch geïnfecteerd met het kloon 13 stam van lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV CL13) 21-24 zijn op grote schaal gebruikt om het fenotype en de functie van effector T-cellen (T eff) en T cellen reg karakteriseren tijdens chronische virusinfectie. Tijdens aanhoudende LCMV infectie, virus-specifieke T eff cellen geleidelijk verliezen hun effector functie en uitgeput raken T (T EXH) cellen. Anderzijds, Treg cellen versterken hun vermogen om virus-specifieke T-cel respons 25 te onderdrukken. De afname van de werkcapaciteit van de T eff cellen kunnen worden verklaard door verschillende factoren zoals verhoogde expressie van remmende receptoren op T eff cellen veranderde functie van antigeenpresenterende cellen, productie van immunoregulerende cytokinen en verhoogde frequentie of verbeterde functie van T reg 26 cellen. Tussen de bij T-cel suppressie factoren, geprogrammeerde celdood eiwit-1 (PD-1) tot expressie brengen T exh-cellen en T-cellen reg zijn algemeen beschouwd als kenmerken antigeen persistentie en onderdrukkende omgeving. Recentelijk werd gemeld dat blokkade van de PD-1 pathway en verwijdering van T-cellen reg leiden tot verhoogde T cel functie en verminderde viral load bij LCMV chronische infectie 27. Bovendien worden T-cellen geactiveerd reg tijdens chronische infectie van muizen met LCMV 23,25 </sup> en hun onderdrukkende functie wordt versterkt 25. PD-1 wordt sterk tot expressie gebracht op T-cellen reg en exh T-cellen en het niveau van PD-1 door T reg cellen tot expressie correleert met de kracht van de onderdrukkende functie om T-celproliferatie 25 remmen.

We beschrijven een werkwijze om de eigenschappen van geactiveerde T-cellen reg geïsoleerd uit muizen geïnfecteerd met LCMV CL13 en rustende T cellen reg geïsoleerd uit naïeve muizen te vergelijken. Verder leggen wij een reeks processen om geactiveerde T-cellen reg scheiden en onderzoeken hun ex vivo fenotype, en meten hun onderdrukkende activiteit in vitro.

Protocol

In dit onderzoek werden muizen in een specifieke pathogeenvrije faciliteit van de Yonsei Laboratory Animal Research Center van de Yonsei University onderhouden. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Korean Food and Drug Administration richtlijnen met behulp van protocollen door de International Animal Care en gebruik Comite van de Yonsei Laboratory Animal Research Center aan de Yonsei University goedgekeurd. 1. Voorbereiding van de Solutions Berei…

Representative Results

We gegenereerd muizen met hardnekkige virus infectie door het injecteren van hen met 2 x 10 6 pfu van LCMV CL13 intraveneus. De fenotypische veranderingen in T-cellen en T reg conv cellen tijdens chronische virusinfectie te onderzoeken, werden milt-lymfocyten van naïeve en geïnfecteerde muizen gekleurd met verschillende antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. Bij 16 pi d, PD-1 werd opgereguleerd in beide Foxp3 – CD4 + T <…

Discussion

Hoewel slechts een klein aantal T-cellen reg bestaan ​​in muizen en mensen, is het belangrijk om de functie te begrijpen omdat zij een cruciale rol bij het ​​reguleren van de immuunrespons en immuun tolerantie spelen. Het aantal en de onderdrukkende functie van T-cellen reg stijgt tijdens een chronische virusinfectie 15-20 evenals de progressie van kanker 13,14. Dit komt waarschijnlijk door aanhoudend antigeen stimulatie. De T cellen reg functioneren onder a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

Materials

FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714 Use this reagent for cell surface staining.
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655 Use this reagent for cell surface staining.
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cell strainer, 70mm BD Biosciences 352350 Use this strainer for grinding the whole spleen.
Cell strainer, 40mm BD Biosciences 352340 Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1X) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901 Use this column for Treg cell isolation
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401 Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation
EDTA, 0.5M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences Flow cytometer*
Flowjo TreeStar Flow cytometry software†
Hematocytomer Marienfeld superior
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Tags

Regulatory T CellsChronic Lymphocytic Choriomeningitis VirusPhenotypic AnalysisFunctional AnalysisIn Vitro SuppressionCD4+CD25+ CellsCD8+ Responder T CellsAnti-CD3/CD28 BeadsCytokine Production
check_url/54138?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image