Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica
Summary
Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Abstract
As células T reguladoras (Treg), que expressam Foxp3 como um factor de transcrição, são subconjuntos de células T CD4 +. Células T reg desempenham um papel crucial na tolerância imunitária e a manutenção da homeostasia através da regulação da resposta imunitária. A função primária de células T REG é o de suprimir a proliferação de células T (FEP) T efectoras e a produção de citocinas tais como IFN-γ, TNF-α, e IL-2. Tem sido demonstrado que a capacidade das células T reg 'para inibir a função das células T ef é aumentada durante a infecção persistente de agentes patogénicos e o desenvolvimento do cancro. Para esclarecer a função das células T reg sob repouso ou inflamadas condições, uma variedade de ensaios in vitro utilizando células de supressão de reg do mouse ou T humana foram concebidas. O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método para comparar as diferenças de fenótipo e função supressora entre descanso e reg T ativadascélulas. Para isolar as células T ativadas reg, camundongos foram infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) clone 13 (CL13), a tensão crônica de LCMV. Células T reg isoladas a partir do baço de ratinhos infectados por LCMV-CL13 exibiu tanto o fenótipo activada e actividade supressora melhorada em comparação com as células em repouso reg T isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Aqui, descrevemos o protocolo básico para ex vivo análise de fenótipo para distinguir células T ativadas reg de descansar células T reg. Além disso, descreve-se um protocolo para a medição da actividade supressora de células T reg totalmente activadas.
Introduction
As células T reguladoras (T reg) expressam caixa de forkhead P3 (Foxp3) como um fator de transcrição para o seu desenvolvimento e função 1. Além disso, as células reg T expressam várias outras moléculas, tais como CD25 2, gene de linfócitos-activação 3 (LAG-3) 3, tumor do receptor do factor de necrose induzida por glucocorticóides 4, e citotóxica-T-linfócito proteína associada 4 (CTLA-4) 5 na sua superfície ou a região intracelular. Durante a infecção crónica com vários tipos de agentes patogénicos, tais como vírus, bactérias 6,7 8,9 e parasitas 10-12, ou no curso de desenvolvimento de câncer 13,14, as células T reg tornar-se diferenciado em células ativadas, exibindo função supressora reforçada As células alvo efetoras CD4 + e CD8 +. Um número de estudos sugerem que as células T reg expandido e de contribuir para os respons de células T CD8 + com deficiênciae durante amigo retrovírus (FV) infecção por 15-17. As células T-reg induzidas FV inibir IFN-γ ou expressão granzima B e reactividade citotóxica de células T CD8 + 15-17. Além disso, num modelo de infecção pelo vírus herpes simplex, foi relatado que a depleção de células T CD4 + reg CD25 + resultou na expansão das células T CD8 + específicas do vírus e lesões graves no tecido por infiltração de células T CD4 + imunopatogênicos 18-20.
Os ratinhos infectados cronicamente com o clone 13 de estirpe do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV CL13) 21-24 têm sido amplamente utilizados para caracterizar o fenótipo e função de células T efectoras (T) e células eff reg T durante a infecção crónica de vírus. Durante a infecção LCMV persistente, células eff específico do vírus T progressivamente perdem a sua função efetora e tornar-se células esgotadas T (T exh). Por outro lado, tcélulas reg reforçar a sua capacidade de suprimir a resposta de células específicas do vírus T 25. A diminuição da capacidade de funcionamento das células eff T pode ser explicada por vários factores, tais como sobre-regulação de receptores inibitórios sobre células eff T, função alterada das células apresentadoras de antigénio, da produção de citocinas imunorreguladoras, e frequência aumentada ou função aumentada de reg t As células 26. Entre os factores envolvidos na supressão de células T, a morte celular programada proteína-1 (DP-1) -expressing EXH células T e células T reg têm sido amplamente consideradas como características de persistência do antigénio e ambiente supressiva. Recentemente, relatou-se que o bloqueio da via de DP-1 e de ablação de células T reg levar a função de células T aumentada e diminuição da carga virai durante a infecção crónica por LCMV 27. Além disso, as células T reg são activadas durante a infecção crónica de ratos com LCMV 23,25 </sup> e sua função supressora é reforçada 25. DP-1 é altamente expressa em células T reg, bem como células T de escape, e o nível de DP-1 expressa por células T reg correlaciona-se com a força da sua função supressora de inibir a proliferação de células T 25.
Aqui, nós descrevemos um método para comparar as características de células T activadas reg isolados a partir de camundongos infectados com LCMV CL13 e as células T em repouso reg isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Além disso, vamos explicar uma série de processos para separar as células T activadas e reg examinar o seu fenótipo ex vivo, bem como medir a sua actividade supressora in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora apenas um pequeno número de células T reg existir em ratos e seres humanos, é importante compreender a sua função que desempenham um papel crucial na regulação da resposta imunitária e manutenção da tolerância imunológica. Os números e supressivas funções de T reg células aumenta durante uma infecção pelo vírus crônica 15-20, bem como a progressão do câncer 13,14. Isto é provavelmente devido à estimulação com antigénio continuou. Para avaliar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
Materials
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
| Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
| PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
| L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
| Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
| CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
| Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
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