胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
異なる遺伝的背景の2匹の動物の外科並体結合は、異なる遺伝的設定で細胞固有の関心の候補遺伝子のための細胞外因性の役割、細胞の移動行動、および分泌シグナル対を研究するユニークなシナリオを作成します。並体結合動物が共通の循環を共有しているため、一匹の動物からの血液や血液媒介因子は、そのパートナーとその逆と交換されます。したがって、一つの遺伝的背景に由来する細胞および分子因子は、第二の遺伝的背景との関連で研究することができます。成体マウスの並体結合研究の老化、癌、糖尿病、肥満、および脳の発達に広く使用されています。さらに最近では、ゼブラフィッシュ胚の並体結合は、造血の発生生物学を研究するために使用されています。マウスとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚の透明な性質は、それFを調査するためのユニークでパワフルな方法作り、並体結合文脈での細胞の直接可視化を可能にしますundamental細胞および分子メカニズム。この技術の有用性は、しかし、並体結合ゼブラフィッシュ胚を生成するための急な学習曲線によって制限されます。このプロトコルは、関心のある候補遺伝子の役割を調べるために、異なる遺伝的背景の2ゼブラフィッシュの胚の胞胚を融合外科的にする方法についてステップバイステップの方法を提供します。また、並体結合ゼブラフィッシュ胚を可能遺伝子発現の時間的制御を行う、熱ショックに対して耐性です。この方法は、高度なセットアップを必要とし、胚発生の間、in vivoでの細胞遊走、運命の仕様、および分化を研究するための幅広い用途を持っていません。
Introduction
野生型および遺伝子改変動物の間の遺伝的モザイク（キメラ）の作成 は、細胞固有の候補遺伝子1-6の細胞外部関数に対する調査するための十分に確立し、古典的な戦略です。ゼブラフィッシュにおける胞胚移植は広く、細胞自律7-9の研究のためのキメラ胚を生成するために利用されてきました。目的の組織に応じて、しかし、予想通り、所望の組織（ 例えば、血液）1-3、7-9にドナー細胞を標的化するために挑戦することができます。マウスの遺伝学者は、長い共有循環10-14と結合した生物を生成するために、並体結合外科的方法を利用してきました。並体結合動物が共通の血流を共有しているため、異なる遺伝的背景の他の動物の細胞と一匹の動物由来の細胞間の相互作用は、10-16を研究することができます。最近、カリマ喫茶のグループは、エレガントなCREする能力を示しました移行15（HSPC）結合したゼブラフィッシュ胚を食べ、その後、造血幹細胞および前駆細胞を研究するためにこのシステムを使用しています。また、ゼブラフィッシュ並体結合は最近、造血幹細胞（HSC）の出現と移行、16で内皮カドヘリン5の役割を調査し、ゼブラフィッシュの開発17時のHSPCのニッチで間質細胞の役割を研究するために使用されました。
マウスとは異なり、ゼブラフィッシュの胚は透明であり、システムがユニークでパワフルな作り、並体結合開発中の細胞の直接可視化を可能にします。ゼブラフィッシュにおける並体結合の有用性は、しかし、急な学習曲線によって制限され、かつ繊細な胚上の並体結合手術は、詳細な指示とビジュアルデモせず、技術的に挑戦することができます。このプロトコルの目的は、研究するための並体結合ゼブラフィッシュの胚を生成する方法についてのビデオベースのチュートリアルを伴うために明確な、ステップバイステップの命令のセットを提供することです時間的、細胞固有の、または胞胚を開発するの外科的融合による候補遺伝子（複数可）の細胞外部関数。増加parabiont生存と新しい実験的なアプリケーションのためのキーの変更や追加の推奨事項が含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
並体結合融合は、大人のマウスモデルおよびニワトリ胚10-14で候補遺伝子の細胞機能を調査するための強力なツールとなっています。より最近では、胞胚融合方法は、結合したゼブラフィッシュ胚15を生成するために記載されています。本プロトコルでは、ビデオベースのチュートリアルを示し、より良い造血開発に関心のある候補遺伝子の、一時的なセル固有の、お…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
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