Generering av Parabiotic Sebrafisk embryoer ved Kirurgisk Fusion of Utvikling Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
Kirurgisk parabiosis av to dyr av ulike genetiske bakgrunn skaper en unik situasjon for å studere celle iboende versus celle ytre roller for kandidat gener av interesse, trekkende atferd av celler, og utskilling av signaler i forskjellige genetiske innstillinger. Fordi parabiotic dyr som deler en felles sirkulasjon, vil en hvilken som helst blod eller blodbåret faktor fra ett dyr utveksles med sin partner og vice versa. Således kan celler og molekylære faktorer avledet fra en genetisk bakgrunn studeres i sammenheng med et andre genetisk bakgrunn. Parabiosis av voksen mus har blitt brukt i stor utstrekning for å forskning aldring, kreft, diabetes, fedme, og utvikling av hjernen. Flere nylig, parabiosis av sebrafisk embryoer har blitt brukt til å studere utviklingsbiologi hos hematopoiesis. I motsetning til mus, den gjennomsiktige natur av sebrafisk embryoer tillater direkte visualisering av celler i parabiotic sammenheng, slik at det er en entydig kraftig metode for undersøkelse av fundamental cellulære og molekylære mekanismer. Nytten av denne teknikken, men er begrenset av en bratt læringskurve for å generere parabiotic sebrafisk embryoer. Denne protokollen gir en trinn-for-trinn metode om hvordan man kirurgisk smelte blastulae av to sebrafisk embryoer fra ulike genetiske bakgrunn for å undersøke hvilken rolle kandidat gener av interesse. I tillegg parabiotic sebrafisk embryoer er tolerante for varmesjokk, slik at temporal kontroll av genekspresjon mulig. Denne metoden krever ikke en sofistikert oppsett og har bred programmer for å studere celle migrasjon, skjebne spesifikasjon, og differensiering in vivo under embryonal utvikling.
Introduction
Opprettelse av genetiske mosaikk (kimærer) mellom villtype og genmodifiserte dyr er et veletablert og klassisk strategi for å undersøke celle iboende versus celle ytre funksjoner av kandidatgener 1-6. Blastula transplantasjon i sebrafisk har vært mye brukt til å generere kimære embryoer for studier av celle autonomi 7-9. Avhengig av vev av interesse, men det kan være vanskelig å målrette forutsigbar donorcellene til den ønskede vev (for eksempel blod) 1-3, 7-9. Muse genetikere har lenge benyttet parabiotic kirurgiske metoder for å generere siamesiske organismer med felles sirkulasjon 10-14. Fordi parabiotic dyrene har en felles blodet, kan interaksjoner mellom celler som stammer fra ett dyr med celler av andre dyr av en annen genetisk bakgrunn studeres 10-16. Nylig, Karima Kissa gruppe elegant demonstrert evne til å Crespiste siamesiske sebrafisk embryo og deretter bruke dette systemet til å studere blodkreft stilk og stamceller (HSPC) migrasjon 15. I tillegg ble sebrafisk parabiosis nylig brukt til å undersøke hvilken rolle endothelial cadherin 5 i stamcelle (HSC) veksten og migrasjon, 16 og å studere rollen av stromale celler i HSPC nisje i sebrafisk utvikling 17.
I motsetning til mus, sebrafisk embryoer er transparente og gir mulighet for direkte visualisering av cellene under parabiotic utvikling, noe som gjør at systemet unikt kraftig. Nytten av parabiosis i sebrafisk, men er begrenset av en bratt læringskurve, og parabiotic kirurgi på de delikate embryo kan være teknisk utfordrende uten detaljert instruksjon og visuell demonstrasjon. Målet med denne protokollen er å gi et sett av klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å følge videobaserte veiledninger om hvordan å generere parabiotic sebrafisk embryoer for å studeretemporal, celle-egenverdi, eller celle ytre funksjoner av en kandidat genet (e) ved kirurgisk fusjon for å utvikle blastulae. Viktige endringer og flere anbefalinger for å øke parabiont overlevelse og nye eksperimentelle programmer er inkludert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parabiotic fusjon har vært et kraftig verktøy for å undersøke cellulære funksjoner av kandidatgener hos voksne murine modeller og kyllingfoster 10-14. Mer nylig har en blastula fusjon metoden blitt beskrevet for å generere siamesiske sebrafisk embryoer 15. I den foreliggende protokollen, videobaserte veiledninger brukes til å demonstrere og bedre beskrive metodikk for å skape parabiotic sebrafisk embryo av ulike genetiske bakgrunn for å studere tidsmessige, celle egenverdi, og celle ytre r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
