최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
호흡기 세포 분화 및 기능의 처리를 연구하는 유용한 모델을 공기 – 액체 계면 상태를 제공하여 기본 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 시험 관내 배양한다. 지난 몇 년 동안, 유전자 전달에 대한 렌티 바이러스 벡터의 사용은 일반적인 관행이되었다. 특정 비 HIV 의사 입력 렌티 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입의보고가 있지만, 전체의 전달 효율이 일반적으로 15 % 미만이다. 여기에 제시된 프로토콜은 신뢰할 수 있고 효율적인 방법 렌티 바이러스를 제조하고,이 차 인간 기관지 상피 세포를 형질 도입하기를 제공한다. 세포가 부착하는 동안 4 감염 인자의 다양성과 함께, 미분화 기관지 상피 세포, 기관지 상피 성장 배지에서 형질을 사용하여 100 %에 가까운 효율을 제공한다. 이 프로토콜은, 단계적으로 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 및 제의 제조와 농도를 설명전자 전달 방법. 이는 일차 인간 기관지 상피 세포 transductions 고효율을 달성하기 위해 최적 배양 조건을 결정 실험을 설명한다.
Introduction
복제 결함, pseudotyped 렌티 바이러스의 개발 (LV)는 관내 1 유전자를 전달하기 위해 안전하고 효율적인 방법으로 연구자를 제공하고 있습니다. 그들의 장기 표현이 LV는 또한 생체 내에서 2,3- 치료제의 전달을 위해 사용될 수있다. LV의 생산은 여러 플라스미드 인간 배아 신장 (HEK) 세포의 공동 – 형질 필요 전이 벡터 포장 개그 / 폴, 포장의 회전을하고, 수 포성 구내염 바이러스 당 단백질 (VSV-G) 플라스미드 봉투. 레브 유전자하여 복제 가능 렌티 바이러스를 생산하는 재조합의 가능성을 감소시키는, 별도의 패키징 플라스미드 인코딩되기 때문에 제 3 세대 포장 시스템은 제 2 세대 시스템보다 안전한 것으로 간주된다. 2 세대 포장 시스템 다섯 배 더 높은 총 전달 유닛을 수득하지만, 원래의 바이러스 게놈의 분할 만드는3 세대 시스템은 최소한 3,4- 전달 레벨이 감소하고있다.
세포주를보다 쉽고 효율적으로 형질 도입 될 수 있지만 이러한 생체 더 대표는 5,6 어떤 조직이 있기 때문에, 연구자들은 일차 전지에 그들의 초점을 이동하고있다. 그러나, 일차 전지는 전달하는 내화물이다. 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입이보고되었지만, 전체 효율은 15 % 7을 초과하지 않았다.
높은 역가의 정맥 주사의 생산을 가능하게하는 프로토콜은 여기에 설명한다. 단계별 접근법은 기본 HBE 세포로 거의 100 % 형질 도입 효율을 달성하기 위해 설명된다. 구체적으로는, 프로토콜은 3 성공 쓸모 최적 배양 조건을 설명한다. 간단히, HEK의 293T 세포는 향상된 녹색 형광의 EF-1 프로모터 구동 식으로 렌티 바이러스 발현 벡터 pCDH를 사용하여 형질단백질 (eGFP는) mCherry 또는 적색 형광 단백질, 및 제 3 세대의 패키징 시스템. 미디어에 발표 정맥 주사 이후 24 시간 (72)에 수집된다. 바이러스 입자는 P24 항원의 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트를 사용하여 역가를 추정하기 전에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 바이러스의 농도를 더욱 간편한 방법에 집중된다. 4 (MOI) 인자 감염 다중도에서 (트립신 처리 후)에 부착하는 동안 계속해서, 미분화 차 HBE 셀 (hexadimethrine 브로마이드를 첨가하고, 16 시간 동안 배양하고, 증식 배지 (기관지 상피 성장 배지 또는 BEGM) (8)에 형질 도입되고 밤새). 세포는 분화 할 수있다. 바이러스 유전자는 (설명을 참조 적절한 프로모터를 사용하는) 장기간 발현되므로, 발현은 pseudostratified기도 상피 세포로의 분화에 걸쳐 유지된다 또는 분화 후 (유도 성 프로모터를 사용하여) 유도 될 수있다.
<p cl엉덩이 = "jove_content은">이 프로토콜은 세포주 대신 차 HBE 세포를 사용하고자하는 연구자들에게 폭 넓은 관심, 그리고 세포 유형을 형질 도입하는 다른 어려움에 적용 할 수 있습니다.Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 100 % 전달 효율에 가까운 보장합니다. 그러나,이 목표를 달성하기 위해 중요한 과정에서 단계가있다. 예를 들어, 형질 전환 과정은 형질 믹스 석출물의 존재 (드롭) 또는 접시에 형질 도입 (도 1b 및 d) 다음날 좋은 형질 대한 중요한 양이다. 침전 또는 응집의 존재 유무는 형질 전환 시약 중 하나의 누락, pH가 문제 또는 불량 플라스미드 제조에 기…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 폐를 제공하기 위해 마이애미 대학의 생명 얼라이언스 장기 복구 기관 감사합니다. 우리는 또한 우리는 또한 가브리엘 Gaidosh 감사도 2b 및 3-D, C.에도 3a에 실험에 사용되는 mCherry 바이러스 박사 벤 Gerovac 리사 노박에 나타난 실험에 사용되는 DNA의 준비를 위해 박사 리사 Künzi 감사합니다 이미징 시설에서, 마이애미 대학 안과학 교실.
본 연구는 NIH의 CF 재단과 박사 마티아스 Salathe에 승무원 의학 연구소에서 보조금을 후원하고있다.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
