Оптимальное Лентивирус производства и клеточной культуры условия, необходимые для успешного трансдукции Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
В пробирке культуре первичных бронхиального эпителия (HBE) клеток человека с использованием условий радиоинтерфейса-жидкость обеспечивает полезную модель для изучения процессов дифференцировки и функции клеток в дыхательных путях. За последние несколько лет, использование лентивирусов векторов для доставки трансгенной стала обычной практикой. Хотя имеются сообщения о трансдукции полностью дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей с некоторыми не связанными с ВИЧ псевдо-набран лентивирусах, общая эффективность трансдукции, как правило, менее 15%. Протокол, представленные здесь, обеспечивает надежный и эффективный способ получения лентивирусов и трансдуцировать первичных бронхиальных эпителиальных клеток. Использование недифференцированные бронхиальных эпителиальных клеток, трансдукции в бронхиальных эпителиальных среде для роста, в то время как клетки придают, с кратностью фактора инфекционного 4 обеспечивает эффективность близко к 100%. Этот протокол описывает, шаг за шагом, подготовки и концентрации векторов лентивирусов с высоким титром и гое процесс трансдукции. В нем рассматриваются эксперименты, которые определены оптимальные условия культивирования для достижения высокоэффективных первичных каскадов, бронхиальных эпителиальных клеток человека.
Introduction
Развитие репликации исправный, pseudotyped лентивирусах (LV) предоставила исследователям безопасный и эффективный метод для доставки трансгенов в пробирке 1. Из – за их долговременной экспрессии, эти LV также могут быть использованы для доставки терапевтических агентов в естественных условиях 2,3. Производство РН требует Котрансфекция эмбриональной почки человека (НЕК) клеток с несколькими плазмид: вектор переноса, упаковки кляп / Pol, упаковки оборот, и конверт вируса везикулярного стоматита (VSV гликопротеин-G) плазмид. Упаковочные системы третьего поколения считаются более безопасными , чем системы второго поколения , так как ген Rev кодируется на отдельной упаковочной плазмиды, тем самым уменьшая возможность рекомбинации , чтобы произвести к репликации лентивирус. Хотя упаковочные системы второго поколения дают пять раз выше, общее количество единиц трансдукции, раскол исходного вирусного генома, чтобы создатьсистема третьего поколения уменьшился уровень трансдукции только минимально 3,4.
В то время как клеточные линии могут быть трансдуцированных более легко и эффективно, исследователи сосредоточили свое внимание на первичные клетки, поскольку они являются более репрезентативными в естественных тканей 5,6. Однако первичные клетки невосприимчивыми к трансдукции. В то время как трансдукция полностью дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей сообщалось, общая эффективность не превышает 15% 7.
Описанный здесь протокол, который позволяет производить с высоким титром LVs. Подход шаг за шагом излагается достичь почти 100% эффективности трансдукции в первичные клетки HBe. Более конкретно, протокол описывает оптимальные условия культивирования инструментальными для успеха 3. В кратком изложении, клетки 293Т НЕК трансфицируют с использованием лентивирусов вектора экспрессии PCDH с промотором стимулировать экспрессию EF-1 усиленного зеленого флуоресцентногобелка (EGFP) или mCherry, красный флуоресцентный белок, а также систему упаковки третьего поколения. LVs, выбрасываемых в СМИ собирают от 24 до 72 ч позже. Вирусные частицы концентрируются с полиэтиленгликолем (ПЭГ), удобный и простой метод концентрации вируса, прежде чем оценить титром с использованием набора антигена р24 твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Впоследствии недифференцированная первичные клетки HBE трансдуцируют в средах пролиферации (бронхиальные эпителиальные среде роста или BEGM) 8, в то время как имеется (после того , как трипсином), при множественности инфекции (MOI) в 4 раза, добавляя бромид hexadimethrine и инкубирование в течение 16 ч ( с ночевкой). Клетки затем дают возможность дифференцировать. Так как вирусный трансген экспрессируется в долгосрочной перспективе (с использованием соответствующего промотора, обсуждение см), выражение будет поддерживаться во время дифференцировки в псевдомногослойный эпителии дыхательных путей или могут быть вызваны (используя индуцируемый промотор) после дифференцировки.
<p clпопка = "jove_content"> Этот протокол представляет широкий интерес для исследователей, которые хотят использовать первичные клетки HBe вместо клеточных линий, и может быть адаптированы к другим трудно трансдукции типов клеток.Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описано здесь обеспечивает почти 100% эффективности трансдукции. Тем не менее, есть шаги в процессе, которые являются важными для достижения этой цели. Например, во время процесса трансфекции, наличие преципитатов в трансдукции смеси (капли) или в чашке на следующий день после т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Life Alliance Organ восстановления Агентство Университета Майами для обеспечения легких. Мы также благодарим доктора Лиза Кюнци для получения ДНК, используемой для экспериментов, показанных на рисунке 2B и 3-D, д-р Бен Gerovac и Лиза Новак для вируса mCherry используется для экспериментов на фигурах 3А до C. Мы также благодарим Габриэль Gaidosh от объекта изображения, отделение офтальмологии в университете Майами.
Это исследование спонсируется за счет грантов от NIH, на CF Foundation и стюардесса медицинского научно-исследовательского института д-ру Matthias Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
