Optimal Lentivirus Produksjon og cellekultur betingelser nødvendig for å kunne omsette Primær Menneskelig Bronkial epitelceller
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
In vitro-kultur av primære humane bronkiale epitel (HBE) celler ved anvendelse av luft-væske-grenseflate betingelser gir en nyttig modell for å studere prosesser av celledifferensiering i luftveiene og funksjon. I de siste årene har bruken av lentivirale vektorer for transgenet levering ble vanlig praksis. Mens det er rapporter om transduksjon av fullt differensierte luftveis epitelceller med visse ikke-HIV-pseudo-skrev lentiviruses, er den samlede transduksjon effektivitet vanligvis mindre enn 15%. Protokollen presenteres her gir en pålitelig og effektiv metode for å produsere lentiviruses og å omsette primære humane bronkiale epitelceller. Ved hjelp av udifferensierte bronkiale epitelceller, transduksjon i bronkial epitelial vekstmedier, mens cellene feste, med en multiplisitet av infeksjon faktor på 4 gir effektivitet nær 100%. Denne protokollen beskriver, trinn-for-trinn, utarbeidelse og konsentrasjonen av høy titer lentiviral vektorer og the transduksjon prosessen. Den drøfter eksperimentene som avgjorde de optimale dyrkningsforhold for å oppnå svært effektive transductions av primære humane bronkiale epitelceller.
Introduction
Utviklingen av replikering-defekt, pseudotyped lentiviruses (LV) har gitt forskere med en trygg og effektiv metode for å levere transgener in vitro 1. På grunn av deres langvarige ekspresjon, kunne disse LV også anvendes for levering av terapeutiske midler in vivo 2,3. Produksjonen av LV krever co-transfeksjon av humane embryonale nyre (HEK) celler med flere plasmider: transfer vektor, emballasje gag / pol, emballasje rev, og konvolutt vesikulær stomatitt viruset glykoprotein (VSV-G) plasmider. Tredje-generasjons emballasjesystemer anses som sikrere enn andre-generasjons systemer fordi den rev-gen er kodet på en separat emballasje plasmid, for derved å redusere muligheten for rekombinasjon for å fremstille et replikasjonskompetente lentivirus. Selv om andre generasjon emballasjesystemer gir fem ganger høyere totale transduksjon enheter, til delingen av den opprinnelige virusgenomet skapeden tredje generasjons system har redusert nivået av transduksjon bare minimalt 3,4.
Mens cellelinjer kan omformes mer enkelt og effektivt, har forskere skiftet fokus til primærceller, fordi disse er mer representativt for in vivo vev 5,6. Men primære celler er ildfaste til transduksjon. Mens transduksjon av fullt differensierte luftveis epitelceller er rapportert, har den totale effektiviteten ikke oversteg 15% 7.
Beskrevet her er en protokoll som tillater produksjon av høy titer LVS. En trinn-for-steg tilnærming er skissert for å oppnå nesten 100% transduksjon effektivitet i primær HBE celler. Mer spesifikt beskriver protokollen optimale dyrkningsforhold instrumentale å lykkes tre. I korthet, blir HEK-293T-celler transfektert ved hjelp av lentiviral ekspresjonsvektoren pCDH med EF-1 promotoren som driver ekspresjon av forbedret grønn fluorescerendeprotein (EGFP) eller mCherry, en rød fluorescerende protein, og en tredje generasjons pakkesystem. LVS slippes ut i media samles 24-72 timer senere. Viruspartiklene er konsentrert med polyetenglykol (PEG), en praktisk og enkel metode for viruskonsentrasjon, før titer estimering ved bruk av et p24-antigen enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) kit. Deretter blir udifferensierte primære HBe-celler transdusert i proliferasjon media (bronkial epitelial vekstmedium eller BEGM) 8, mens feste (etter blir trypsinert), ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) faktor på 4, og legger hexadimethrine bromid og inkubering i 16 timer ( over natten). Cellene blir deretter lov til å differensiere. Siden virale transgenet blir uttrykt langtids (ved hjelp av passende promoter, se diskusjon), vil ekspresjon opprettholdes gjennom differensiering til en pseudostratified luftveisepitel eller kan være indusert (ved bruk av en induserbar promoter) etter differensiering.
<p class = "jove_content"> Denne protokollen er av bred interesse for forskere som ønsker å bruke primære HBE celler i stedet for cellelinjer, og kan være tilpasningsdyktig til andre vanskelige å omsette celletyper.Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen skissert her sikrer nær 100% overføringseffektivitet. Men det er skritt i prosessen som er viktig for å oppnå dette målet. For eksempel, under transfeksjon prosessen, tilstedeværelse av bunnfall i den transduksjon mix (drop) eller i fatet dagen etter transduksjon (fig 1 b og d) er begge relevante for en god transfeksjon. Fraværet av et bunnfall eller tilstedeværelsen av agglomerater kan være på grunn av en utelatelse av en av de transfeksjon reagensene, en pH probl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Liv Alliance Organ Recovery Agency ved Universitetet i Miami for å gi lungene. Vi takker også Dr. Lisa Künzi for DNA preparat som brukes for eksperimentene er vist i figur 2B og 3-D, Dr. Ben Gerovac og Lisa Novak for mCherry virus anvendt for eksperimentene i figur 3A til C. Vi takker også Gabriel Gaidosh fra fotostudio, Department of Ophthalmology ved Universitetet i Miami.
Denne studien har blitt sponset med tilskudd fra NIH, CF Foundation og Flight Attendant Medical Research Institute Dr. Matthias Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
