Summary
Protokollen som presenteres i denne undersøkelse beskriver fremgangsmåter for sanntids overvåkning av reprogrammerings-progresjon gjennom den kinetiske måling av positive og negative pluripotent stamcellemarkører ved hjelp av strømningscytometri-analyse. Protokollen inneholder også bildebasert vurdering av morfologi, og markør eller reporter uttrykk under IPSC generasjon.
Introduction
Pasient-avledet induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er lovende verktøy for celleterapi og narkotika screening. De gir en autolog kilde til celler for terapi. I tillegg omfatter de et meget bredt sett av genetiske bakgrunn, slik at en detaljert in vitro analyser av genetiske sykdommer utover det nåværende embryonale stamceller (ESC) linjer ville tillate. Nylige fremskritt har ført til utvikling av flere metoder for å generere iPSCs, inkludert omprogrammering med Sendai-virus, episomale plasmider eller mRNA 1,2. Spesielt er forskjellige omprogrammering metoder forbundet med varierende grad av effektivitet og sikkerhet, og vil sannsynligvis variere på andre måter som påvirker deres egnethet for ulike bruksområder. Med tilgjengeligheten av en rekke reprogrammerings-teknologi, har det blitt viktig å utvikle metoder for å vurdere den omprogrammering prosessen. De fleste eksisterende metoder er avhengige av den kvalitative inspeksjon av morfologi eller beisingmed stamcelle-spesifikke fargestoffer og antistoffer. En nylig utviklet metode gjør bruk av lentivirale fluorescens reportere som er følsomme for PSC-spesifikk mirnas eller differensierte celle-spesifikke mRNA 3. Slike målemetoder forenkle valg og optimalisering av omprogrammering teknikker for ulike situasjoner. For eksempel har CDy1 blitt brukt som en fluorescerende probe for tidlig iPSCs for å screene for reprogrammerings-modulatorer 4. Evnen til å observere og sammenligne ulike reprogrammerings eksperimenter er også kritisk for å få en bedre forståelse av prosessen i seg selv. For eksempel er det nå kjent at noen somatiske celletyper er lettere å omprogrammere enn andre, 5, og at celler går gjennom mellomliggende tilstander ved reprogrammering 6-8. Dessverre, mekanismene bak omprogrammering prosessen er fortsatt ikke helt forstått og dermed den eksakte forskjeller mellom omprogrammering metoder også gjenstår å være defined. Dermed metoder for overvåking, vurdering, og sammenligne omprogrammering hendelser fortsetter å være kritisk for stamcellefeltet.
Metodene som beskrives i denne protokollen tillater overvåkning og vurdering av de reprogrammerings-prosessen, og illustrerer hvordan disse teknikkene kan anvendes for å sammenligne forskjellige sett med omprogrammering reagenser. Den første tilnærmingen innebærer flowcytometri analyser ved hjelp av kombinasjoner av antistoffer mot positive og negative pluripotent stamcelle (PSC) markører. Den andre tilnærmingen par sanntids avbildning og måling av total konfluens (det prosentvise overflateareal som dekkes av cellene) og løpet av markørsignaler (det prosentvise overflateareal som dekkes av de fluorescerende signaler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.Solution og Medium Forberedelse
- Kjeller Membran Matrix (Renset fra Engelbreth-Holm-Swarm Tumor)
- Langsomt tine basalmembranen matrise (5 ml) på is ved 4 ° C over natten.
- Fortynne stamløsning på 1: 1 med 5 ml iskald, sterilt DMEM / F-12 medium i en steril, på forhånd avkjølt 15 ml konisk rør. Tilsett porsjoner inn i pre-kjølte, 1,5 ml sterile mikro sentrifugerør og umiddelbart lagre ved -20 ° C.
- Før bruk, tiner den frosne 1: 1 basalmembran matriks delmengde over natten ved 4 ° C. På tidspunktet for bruk, ytterligere fortynnes 1: 1 aliquot ytterligere 50 ganger med iskaldt, sterilt DMEM / F-12 medium til en endelig fortynning på 1: 100.
- Tilsett passende mengde av 1: 100 fortynnet basalmembran matriseoppløsning til den aktuelle vevskultur (TC) fartøyer og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Vanligvis bruker 3 ml fortynnet basalmembran matrix løsning å belegge en TC rett of 20 cm 2 areal, belegge alle andre typer av rettene TC / plater ved et forhold på 0,15 ml fortynnet massen pr cm2 overflateareal. Aspirer gjenværende oppløsning før tilsetning av en hvilken som helst kulturmedium og celler.
- fibroblast Medium
- Tine en 100 ml flaske ES kvalifisert føtalt bovint serum (ES-FBS) ved 4 ° C over natten.
- Tilsett 50 ml av det tinte ES-FBS og 5 ml MEM ikke-essensiell aminosyre løsning (1x) til 445 ml DMEM-medium. Steril de kombinerte komponentene gjennom et 0,22 um filter og oppbevares medium ved 4 ° C i opptil 4 uker.
- iMEF Medium
- Tine en 100 ml flaske med ES-FBS ved 4 ° C over natten.
- Tilsett 50 ml av tinte FBS, 5 ml MEM ikke-essensiell aminosyre løsning (1x), og 500 ul 2-merkaptoetanol til 445 ml DMEM-medium.
- Steriliser de kombinerte komponenter gjennom et 0,22 mikrometer filter og lagre megdium ved 4 ° C i opptil fire uker.
- Grunnleggende fibroblastvekstfaktor oppløsning (b-FGF)
- Tilsett 10 mL Serum Replacement til 990 mL av D-PBS og bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 1 ml av 1% (v / v) Serum Replacement løsning til en ampulle med 10 pg lyofilisert b-FGF. Bland forsiktig pipettering opp og ned.
- Delmengde av 10 mikrogram / ml b-FGF løsning i 200 ul porsjoner i mikro-sentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C inntil nødvendig for opptil 4 uker.
- Menneskelig pluripotent stamcelle (hPSC) Medium
- Tine en 100 ml flaske med serum erstatning ved 4 ° C over natten.
- Legg 100 ml av tinte Serum Replacement, 5 ml MEM ikke-essensiell aminosyre løsning (1x), og 500 ul 2-merkaptoetanol til 395 ml DMEM / F-12 medium.
- Steril de kombinerte komponentene gjennom et 0,22 um filter og lagre mediet ved4 ° C i opptil 4 uker.
- På tidspunktet for bruk, forvarme den hPSC mediet til 37 ° C og supplere med 4 ng / ml bFGF.
- iMEF Kondisjonert Medium (CM)
- Legg 18 ml 0,1% gelatin til en T-175-kultur kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern 0,1% gelatinoppløsning etter en times inkubasjon. Legg 9,1 x 10 6 mitotisk-inaktiverte mus embryonale fibroblaster (iMEF) i 45 ml iMEF medium og inkuberes i 37 ° C inkubator over natten.
- Etter inkubering over natten, fjerne den gamle iMEF mediet og vask en gang med 25 ml D-PBS i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer av D-PBS-vask og tilsett 90 ml forvarmet hPSC medium, supplert med 4 ng / ml bFGF. Inkuber i 37 ° C inkubator i nøyaktig 24 timer.
- Etter 24 timers inkubering, aseptisk fjerne hPSC mediet fra iMEF kolben og sterilisere gjennom et 0,22 um filter. Delmengde inn 50 ml koniske rør og fryse ved -20 ° C inntil nødvendig. iMEF CM kan lagres i opp til 6 måneder ved -20 ° C.
- Legge til nye 90 ml forvarmet hPSC medium supplert med 4 ng / ml bFGF til iMEF kolben. Inkuber i 37 ° C inkubator i nøyaktig 24 timer. Gjenta høsting av CM for opp til 7 dager.
- På tidspunktet for bruk, forvarme den iMEF-CM til 37 ° C og supplere med 4 ng / ml bFGF.
- E8 Medium
- Tine en 10 ml E8 supplement ved 4 ° C over natten.
- Fjern 10 ml av E8 basalmedium og aseptisk legge til innholdet i tint E8 supplement til de resterende basalmedium. Bland godt og sterilisere gjennom et 0,22 mikrometer filter. Oppbevar fullstendig medium ved 4 ° C i opptil 2 uker.
- På tidspunktet for bruk, forvarme den aliquot av det medium som skal brukes til romtemperatur. Det er ikke anbefalt å pre-varme E8 Middels til 37 ° C.
- Cell Sårting Buffer
- Fremstille frisk sortering buffer rett før cellesortering ved tilsetning av EDTA-løsning (1 mM endelig konsentrasjon), HEPES-buffer (25 mM sluttkonsentrasjon) penicillin / streptomycin-løsning (100 enheter / ml sluttkonsentrasjon) og bovint serumalbumin (1% sluttkonsentrasjon) i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning (kalsium og magnesium fri).
- Steriliser buffer gjennom et 0,22 mikrometer filter før bruk.
- Cell Sorting Recovery Medium
- Modifisere 50 ml fibroblast medium ved tilsetning av penicillin / streptomycin (100 enheter / ml sluttkonsentrasjon) og Rock Inhibitor Y-27632 (10 pM sluttkonsentrasjon). Forvarme dette mediet til 37 ° C før såing de sorterte cellene.
2. Sendai mediert omprogrammering av humane fibroblaster
- 24 timer før transduksjon med Sendai virus, frø fibroblastene ved en tetthet på 2 x 10 5 calen per brønn i de ønskede brønnene i en 6-brønns plate TC.
- Utfør transduksjon på dag 0 som følger.
- Pre-varme 2 ml fibroblast medium i et 37 ° C vannbad. Fjern ett sett av Sendai virus rør fra -80 ° C lagring og tine hvert rør en om gangen ved først å dyppe bunnen av røret i en 37 ° C vannbad i 5-10 sek, og deretter fjerne røret fra vannet bade og la den tine i romtemperatur. Tint, sentrifuger kort røret og legg det umiddelbart på is.
- Bruke kommersielt andre generasjons Sendai virus ved å tilsette de aktuelle volumene (i henhold til COA) for hvert av rørene for å oppnå den følgende multiplisitet av infeksjon (MOI) til 1 ml av forvarmet Fibroblast medium per brønn som skal omformes som følge : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
- Bland den virale løsning ved pipettering av blandingen forsiktig opp og ned. complete neste steg innen 5 min.
- Aspirer Fibroblast Medium fra brønnen av fibroblaster som skal programmeres, og tilsett 1 ml av den virale løsning til hver brønn. Plassere cellene i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator og inkuberes over natten.
- Etter inkubasjon over natten, aspirer av transduksjon medium og kast den gamle medium riktig (10% blekemiddel for 30 min). Erstatt med 2 ml forvarmet fibroblast Medium og fortsette å dyrke de omsatte cellene.
- Kultur cellene for 6 dager, og erstatte den gamle medium med frisk fibroblast Medium annenhver dag.
Merk: Ikke passasje de omprogrammeres cellene inntil 7 dager etter transduksjon. - Dag 6: tilberede retter for IPSC Generation
- For mater-avhengige IPSC generasjon, tilsett 1,5 ml 0,1% gelatin-løsning til hver brønn av en 6-brønn vevskultur (TC) tallerken og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern det 0,1% gelatin såning etter en time av inkubasjon. Tilsett 3 x 10 5 mitotisk-inaktiverte mus embryonale fibroblaster (iMEF) i 2 ml iMEF medium per brønn og inkuber i 37 ° C inkubator over natten.
- For mater-uavhengig IPSC generasjon, tilsett 1,5 ml fortynnet basalmembran matriksen (1: 100 fortynning) til hver brønn i en 6-brønn vevskultur (TC) tallerken og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Syv dager etter transduksjon, høste transduced fibroblaster og re-plate dem på de ferdiglagde kultur retter for IPSC koloni generasjon.
- Aspirer av normal dyrkingsmediet fra fibroblaster, og vaske cellene en gang med 2 ml D-PBS.
- Aspirer av D-PBS vaske og tilsett 0,5 ml forvarmet 0,05% trypsin / EDTA. Cellene inkuberes i 3 - 5 minutter ved 37 ° C.
- Når cellene har rundet opp, tilsett 2 ml forvarmet fibroblast Medium i hver brønn for å stoppe trypsinering. Løsne cellene fra brønnen ved hjelp av forsiktig pipettering tHan medium over overflaten av parabolen. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml konisk sentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 200 xg i 2 min. Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 2 ml frisk, forvarmes fibroblast Medium.
- Telle celler ved hjelp ønsket metode (hemocytometer eller automatisert celleteller) og frø pre-forberedt kultur retter med 5 x 10 4 celler for mater avhengige forhold og 1 x 10 5 celler for mater uavhengig forhold, per brønn av en seks -vel rett og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 inkubator over natten.
- Etter inkubasjon over natten, bytter mediet som hPSC medium, E8 medium eller iMEF med klimaanlegg media, avhengig av programmet. Skift ut det gamle mediet med friskt medium hver dag etterpå.
3. Sendai omprogrammering av BGO1v hOct4-GFP reporter humane embryonale stamceller (hESC) Avledet Sekundære Fibroblaster
- derive sekundære humane fibroblaster fra BG01v hOct4-GFP reporter hESC linje i henhold til prosedyren beskrevet tidligere ni.
- To dager før transduksjon, plate BGO1v / HOG avledet fibroblaster i to brønner på en seks-brønns plate på 2 x 10 5 celler per brønn, ved hjelp av fibroblast Medium.
- På dagen for transduksjon, pre-varme 2 ml fibroblast Middels til 37 ° C.
- Fjern ett sett av Sendai rør fra -80 ° C lagring. Fjern ampullene fra posen og tine hvert rør en om gangen ved først å nedsenke bunnen av røret i et 37 ° C vannbad i 5 - 10 sekunder, hvoretter, at rørene for å tine ved romtemperatur. Tint, sentrifuger kort røret og legg det umiddelbart på is.
- Legg de angitte volumer av hver av de tre Sendai rørene (se CoA for den aktuelle volum) til 2 ml fibroblast Medium, pre-oppvarmet til 37 ° C og grundig blande den virale løsning ved å pipettere opp og ned. Fullfør neste step løpet av 5 min.
Merk: For dette eksperimentet, en MOI av 5: 5: 6 ble benyttet. - Aspirer Fibroblast Medium fra brønnene i fibroblaster som skal omformes. Tilsett 1 ml av virussuspensjonen til hver av to brønner som skal omformes. Plassere cellene i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator og inkuberes over natten.
- Etter inkubasjon over natten, fjerner transduksjon medium og behandler det riktig (10% blekemiddel for 30 min). Erstatt hver brønn med 2 ml forvarmet fibroblast Medium og fortsette å dyrke de omsatte cellene.
- Kultur cellene for 6 dager, endre gamle medium med frisk fibroblast Medium annenhver dag.
- Syv dager etter transduksjon, høste transduced fibroblaster og re-plate dem på de ferdiglagde kultur retter for IPSC koloni generasjon.
- Aspirer av normal dyrkingsmediet fra fibroblaster, og vaske cellene en gang med 2 ml D-PBS.
- Aspirer av DPBS vaske og tilsett 0,5 ml forvarmet 0,05% trypsin / EDTA. Cellene inkuberes i 3 - 5 minutter ved 37 ° C.
- Når cellene har rundet opp, tilsett 2 ml forvarmet fibroblast Medium i hver brønn for å stoppe trypsinering. Løsne cellene fra brønnen ved forsiktig pipettering av mediet over overflaten av skålen. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml konisk sentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 2 min. Aspirer supernatanten, og re-suspendere cellene i en passende mengde frisk, forvarmet Fibroblast medium.
- Telle celler ved hjelp ønsket metode (hemocytometer eller automatisert celleteller).
- Seed de transduserte celler ved en tetthet på 1 x 10 5 celler per brønn av en basalmembran matrise -belagt 6-brønns plate og inkuberes i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator over natten.
- Etter inkubasjon over natten, bytter mediet som iMEF kondisjonert medium, supplert med 10 ng / ml av b-FGF. Skift ut den gamle medium med frisk iMEF CM hver dag etterpå.
- Tre uker etter transduksjon, mekanisk dissekere og overføre de ønskede kolonier for klonal ekspansjon eller bruk for analyse.
4. Live-Cell Imaging av fibroblast Omprogrammering
- Real-Time Monitoring
- 7 dager etter transduksjon med Sendai omprogrammering kit, frø den ønskede mengde av celler på 6-brønners skåler med de ønskede mellom og matrisesystemer som tidligere beskrevet. Plasser seeded retter inne i imager, som ligger i en fuktet inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO 2.
- Sett bildebehandlingsprogrammer for å fange hele vel bilder av hver enkelt brønn på et sett intervall (hver 6-8 time) for kontinuerlig å ta bilder for de neste 14 dagene henhold til produsentens protokoll.
Merk: Fase kontrast bildeinnstillinger er valgt for normal omprogrammering å evaluere koloni progresjon. I tilfelletav BG01v / HOG avledet fibroblast omprogrammering, er det best å ta bilder i fasekontrast og i det grønne fluorescerende kanal som re-aktivering av endogene OCT4-GFP reporter kan spores gjennom omprogrammering prosessen. - Endre mediet daglig, kan det være hPSC medium, E8 medium, eller iMEF-CM, avhengig av forsøket, som tidligere beskrevet fra dag 8 til 21 etter-transduksjon. Brønnene kan bli ytterligere analysert for kolonidannelse ved hjelp av indirekte immunfluorescens.
- Ved slutten av eksperimentet på dag 19 til 21, fjerne kulturmediet fra hver brønn for å bli probet med antistoffer for fibroblast og stamcelle markører for valg.
- Vask hver brønn en gang med 2 ml forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Fremstille porsjoner av hver positive / negative primære antistoff-par i 1 ml DMEM / F-12 medium som følger: anti-mus SSEA4 (1: 200) og anti-rotte-CD44 (01:50), anti-mus TRA-1- 60 (1: 200) og anti-rotte-CD44 (01:50), og alkalisk fosfatase Live Stain (01:50) og anti-rotte-CD44 (01:50). Tilsett 1 ml primære antistoffløsninger til hvert tilsvarende godt. Inkuber ved 37 ° C i 45 min.
- Aspirer av det primære antistoff-oppløsning og vaskes to ganger med forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Forbered sekundære antistoff løsninger (1 ml for hver brønn) ved hjelp av geit-anti-mus Alexa Fluor 488 konjugert sekundær (1: 500) for grønn fluorescens og geit-anti-rotte Alexa Fluor 594 konjugert sekundær (1: 500) for rød fluorescens i DMEM / F-12 medium. Legg til hver brønn etter siste vask. Inkuber sekundære antistoffer i 30 minutter ved 37 ° C.
Note: På grunn av alkalisk fosfatase Lever Stain s (APLS) transient signal, bør anti-CD44 primær inkubering blir først utført av seg selv og Apls bør legges ved inkubasjon med de sekundære antistoffene - Etter den sekundære antistoff inkubering aspireres fra oppløsningen og vaskes to ganger med DMEM / F-12 medium. Legg frisk forvarmet DMEM / F-12medium til hver brønn før endelig bildeopptak.
- Sett imager programvare for å skaffe hele vel bilder av hver brønn ved bruk av alle tre skanneparametere: fase kontrast, grønn fluorescens og rød fluorescens. Lage bilder på ulike forstørrelser og lage time-lapse filmer med programvare for å overvåke vekst og markør uttrykk. Bruk produsentens protokoll.
- Utnytte analyse programvare, evaluere samløpet av godt over tid i fasekontrast og i grønne fluorescerende enheter for BG01v / HOG omprogrammering.
- Overvåking Omprogrammering mellomprodukter ved hjelp celleoverflaten Markers
- Overvåk omprogrammering hendelser på ulike tidspunkt ved sondering omprogrammering retter på ulike tidspunkter med antistoffer mot ulike stamcelle positive / negative markører for å overvåke omprogrammering prosessen. Probe kulturer hver 2 til 3 dager avhengig av tilgjengeligheten av replikater. Sondere omprogrammering dishes på dag 19 til 21 ved hjelp av dual flekker strategi for å identifisere fullt omprogrammerte IPSC kolonier og delvis omprogrammerte kolonier basert på fargemønstre.
- Ved ønsket tidspunkt, Aspirer av den normale vekstmediet fra hver brønn for å bli probet med antistoffer for markører for valg.
- Vask hver brønn en gang med 2 ml forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Fremstille porsjoner av hver positive / negative primære antistoff-par i 1 ml DMEM / F-12 medium som følger: SSEA4 konjugert til den grønne fluorescerende fluoroforen (1: 200), TRA-1-60 konjugert til den grønne fluorescerende fluoroforen (1: 50), Alkaline Levende Stain (1: 500), CD24 konjugert til en grønn fluorescerende fluorofor (01:50), B2M konjugert til en grønn fluorescerende fluorofor (01:50), EpCAM konjugert til en grønn fluorescerende fluorofor (01:50) , mus CD73 (1: 100) som ble probet med anti-muse-sekundært antistoff konjugert til et grønt fluorescerende fluorofor (1: 500), og rotte CD44 (1:50) som er undersøkt medanti-rotte sekundært antistoff konjugert til den røde fluorescerende fluoroforen (1: 500). Tilsett 1 ml primære antistoffløsninger til hvert tilsvarende godt. Inkuber ved 37 ° C i 45 min.
- Aspirer av det primære antistoff-oppløsning og vaskes to ganger med forvarmet DMEM / F12-medium.
- For konjugerte antistoffer, fortsett til ved hjelp av en to-trinns fremgangsmåte ved fremstilling av de passende sekundære antistoffløsninger og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Bekreft at sekundære antistoffer til de primære verter og ikke kryssreagerer. Utfør tilleggsvasketrinn som tidligere beskrevet.
- Etter alle egnede vasker, legge friske forvarmet DMEM / F-12 medium til hver brønn før endelig bildeopptak.
- Fang fluorescerende bilder under riktig filter ved 100X forstørrelse ved hjelp av et fluorescerende mikroskop og analysere bildene ved hjelp av tilgjengelig programvare for analyse.
5. Måling av Omprogrammering Kinetics Bruk av flyt Cytometry
- Kvantitativ Kinetic Måling av Omprogrammering bruker celleoverflaten Antistoffer
- Før omprogrammering, sette opp riktig antall omprogrammering eksperimenter for hvert tidspunkt. For å måle kinetikk av omprogrammering de første 7 dagene av omprogrammering, er individuelle transductions utført for hver ønsket tidspunkt. For tidspunkter etter Dag 7, frø tilstrekkelige mater uavhengig tidspunkter for å fortsette å måle omprogrammering hendelser. En enkelt brønn av en 6-brønns plate vil gi tilstrekkelige mengder av celler for utførelse av flowcytometri analyse.
- Mål alle ønskede omprogrammering tidspunkter fra enkeltbrønner, da dette er et sluttpunkt analysen. Aspireres av fibroblast medium fra den ønskede brønnen. Vask en gang med D-PBS.
- Aspirer av D-PBS-vask. Tilsett 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning til brønnen som skal testes. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Etter inkubering dissocispiste cellene inn i enkeltceller ved å spyle 1 ml cellesuspensjon mot overflaten av brønnen og overfører suspensjonen til en 15 ml konisk rør. Bruk 3 ml D-PBS for å vaske av eventuelle gjenværende celler fra brønnen og legge dem til i 15 ml konisk. Bruk 10 ml ytterligere D-PBS for ytterligere å fortynne celleløsning i den koniske tube.
- Sentrifuger cellene ved 200 xg i 2 min. Aspirer supernatanten og re-suspendere pelleten i 1 ml DMEM / F-12 medium. Utfør en celletall som trengs for å skape en standard cellesuspensjon som er mindre enn 1 x 10 6 celler / ml.
- Fremstille hver aliquot av positive / negative direkte-konjugerte antistoffer med valg i 1 ml DMEM / F-12 medium for mindre 1 x 10 6 celler / ml ved hjelp av følgende kombinasjoner: SSEA4 konjugert til en grønn fluorescerende fluorofor (1: 200) med CD44 konjugert til PE-Cy5, eller CD44 konjugert til en grønn fluorescerende fluorofor og SSEA4 konjugert til en vidt rød fluorescerende fluoroforen. Inkuberantistoffene med cellesuspensjonen i 45 min ved romtemperatur.
- Aspirer primære antistoff-oppløsning og vaskes to ganger med forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Aspirer endelige vask og re-suspen cellepelleten i 1 ml D-PBS. Pipet innholdet i hver suspensjon i enkelt FACS rør.
- Ved hjelp av de riktige negative kontroller (ufargede og isotype kontroller), bekrefter riktig fremover og sidespredning profil og spenninger på cytometeret. Sett spenningene for de tilsvarende fluorophores henhold til opprinnelige enkle flekk parametere, slik at de grønne fluorophores aktiveres av blå laser og signaler ervervet i BL1 kanal, mens langt rød fluorescerende fluoroforen og PE-Cy5 fluorophore aktiveres av rød laser og signaler ervervet i RL1 kanal. Erverve dual-farget populasjon for hvert tidspunkt.
- Analyser FCS filer for hvert tidspunkt ved hjelp av riktig analyse programvare og bruke editoren til ArraNGE data for å observere populasjonen uttrykket skift over tid.
- Følg trinn 5.1.1 til 5.1.6, hvis celle sortering er ønsket ved ulike tidspunkt. Bruke de riktige fluoroforen kombinasjon i henhold til laser konfigurasjonen av cellesorterer som skal brukes.
- Etter den siste vask, re-suspen cellepelleten i 1 ml av cellesorterings buffer. Sett opp cellen sorter til riktig fremover og side scatter innstillinger ved å bruke en unstained kontroll. Bruk enkle farget kontroller for å sette opp de riktige innstillingene for hvert fluorophore.
- Bruk en liten prøve av dobbel-farget cellesuspensjon; Velg de 2 populasjoner for å bli sortert og tilordne den respektive kostnad for å sikre riktig samling av de sorterte cellene.
- Tilsett 200 ul av celle utvinning medium inn i oppsamlingsrørene for å sikre at den sorterte cellesuspensjonen er polstret og beskyttet ved tidspunktet for sortering. Høste ønsket antall celler og overføre til nye iMEF retter som inneholder ferskly forberedt gjenopprettingsmedium.
- Endre medium følgende natten inkubasjon med gjenopprettingsmedium. Kulturene skal deretter matet og rutinemessig passert ved hjelp av hPSC medium som inneholdt penicillin / streptomycin (100 enheter / ml sluttkonsentrasjon).
6. Endpoint Analysis
- Terminal alkalisk fosfatase (AP) Farging
- Bruk terminal kromogen AP flekker å relatere observerte kinetiske og morfologiske hendelser med endelig omprogrammering effektivitet.
- Etter 21 dagers omprogrammering, fjernes kulturmediet fra den brønnen som blir farget med terminal AP flekken og vask en gang med 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
- Forbered riktig mengde fargeløsning som anvist av produsentens bruksanvisning på 200 mM Tris-HCl.
- Suge vaske og tilsett 2 ml av den klare fargeløsning til hver brønn. Inkuberes i 20 til 30 minutter ved romtemperatur og bort fra the lys.
- Aspirer fargeløsning og vaske en gang med 200 mM Tris HCl. Fjern vask og tilsett destillert vann før visualisering.
- Fang kolo signal ved hjelp av et vanlig bilde kamera. Tell antall positivt fargede kolonier for hånd. Visual flekken ved hjelp av fluorescerende analyse i Trit-C kanal, som flekken er også fluorescerende i naturen og utføre hel-brønn bildebehandling og analysert ved bruk av hel-godt imager. Bruk produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overvåking omprogrammering Kinetics ved hjelp av flowcytometri
CD44 er en fibroblast markør mens SSEA4 er en PSC markør 6,10. Som forventet fra denne uttrykksmønster, strømningscytometri av BJ fibroblaster viser en SSEA4 - CD44 + -populasjonen som muliggjør etableringen av kvadrant porter i kombinasjon med de ufargede prøven. Under omprogrammering av DF1 fibroblaster med Sendai virus, er CD44 gradvis tapt mens SSEA4 langsomt uttrykt. På dag 3 etter transduksjon med Sendai virus, er det en stor bestand av SSEA4 - CD44 + celler og en liten bestand av SSEA4 + CD44 + celler som blir mer tydelig på dag 7 (figur 1). På dag 13, overganger dobbel-positive befolkningen mot SSEA4 + CD44 - tilstand. Av Dag 17, en stor andel av cells i kultur er allerede SSEA4 + CD44 -. Denne gangen kurset viser at flowcytometri med CD44 og SSEA4 kan brukes til å overvåke utviklingen og frekvensen av omprogrammering.
En kvantitativ sammenligning bekrefter at omprogrammering BJ fibroblaster med Sendai omprogrammering virus genererer SSEA4 + CD44 - celler i et annet tempo enn omprogrammering av BJ fibroblaster (Figur 2A). Dataene viser at en tidlig sammenligning av den prosentandel av PSC-lignende SSEA4 + CD44 - celler som sporer utviklingen av omprogrammering. Interessant, ved dag 8 av DF1 fibroblast omprogrammering, sortering og separat dyrkning av populasjonen av celler som er i ferd med oppregulering SSEA4 og downregulating CD44 genererer AP + kolonier 11 (figur 2B). I motsetning til den opprinnelige SSEA4 - CD44 + -populasjonen genererer amuch mindre antall AP + kolonier på dag 21 av omprogrammering, som er typisk dag endelige koloni analyse. Dette tyder på at det er mulig å kvantifisere og sammenligne overgangen befolkningen for å forutsi forskjeller i omprogrammering kinetikk selv før SSEA4 + CD44 - befolkningen er dannet. Et viktig punkt å merke seg her, er at omprogrammering er en variabel prosess avhengig av flere faktorer, for eksempel som utgangssomatiske cellepopulasjon, transduksjon effektivitet, medium, etc. Men det generelle mønster og progresjon av de ovenfor beskrevne overflatemarkører er ulik for forskjellige eksperimenter og omprogrammering starter fibroblaster. Analysen av omprogrammering kinetikk kan også gjøres med ulike markører, slik som de nylig identifiserte negative PSC markører CD73 og B2M 6, samt de etablerte PSC markørene CD24 12,13 og EpCAM 14,15. I likhet med CD44, CD73 og B2M er uttrykt i parental BJ fibroblaster, men er nedregulert i løpet av omprogrammering, blir umulig å oppdage i fullt omprogrammeres iPSCs (figur 3A). En flowcytometri tidsforløp ved hjelp av CD44 og CD73 eller CD44 og B2M viser at CD44 og CD73 er nedregulert med en lignende hastighet, mens B2M er nedregulert raskere enn CD44 (figur 3B). I begge tilfeller kan graden av omprogrammering observeres ved å måle akkumuleringen av den doble negative befolkningen. I motsetning til disse negative PSC markører, CD24 og EpCAM er fraværende i fibroblaster og er uttrykt i iPSCs (figur 3A). I en flowcytometri tid selvfølgelig, CD24 - CD44 + og EpCAM - CD44 + fibroblaster slutt danne dobbel-negative populasjoner som senere overgang til CD24 + CD44 - og EpCAM + CD44 - PSC-lignende celler, henholdsvis (figur 3B). Dermed under omprogrammering, både positive PSC markøreruttrykkes etter CD44 er nedregulert. I likhet med det som ble observert med SSEA4 og CD44, dannelse og opphopning av ulike cellepopulasjoner indikerer utviklingen av omprogrammering.
Sporing Omprogrammering Bruke Real-time Imaging Analysis
Sanntids avbildning av omprogrammering kulturer etter reseeding viser den gradvise dannelsen av kolonier (figur 4A), noe som tilsvarer en logaritmisk økning i konfluens i henhold til fasekontrast (figur 4B). Confluence under fase kontrast gir dermed en annen beregning for overvåking omprogrammering kvantitativt, men det omfatter både, koloniene som er positive for PSC markører og fortsatt spredning av unreprogrammed eller delvis omprogrammeres celler (figur 4A, siste panel). Kvantifisere de områdene som har blitt farget for pluripotency markørerTRA-1-60, SSEA4 og AP 6,10 på dag 21 indikerer at iPSCs bare utgjør mindre enn halvparten av den totale løpet (figur 4B). For å måle fremgangen omprogrammering strengere, er det mulig å bruke en reporter linje for omprogrammering. Her ble sekundære fibroblaster generert fra BG01v / HOG ESC linje, som er konstruert med en OCT4-GFP reporter 16. GFP er uttrykt som cellene omprogrammeres og som er dannet kolonier (figur 5A). Måling samløpet under fase kontrast og de grønne kanaler viser at GFP samløpet øker langsommere enn den totale samløpet, og GFP løpet på dag 19 er mindre enn halvparten av den totale løpet (figur 5B), som minner om TRA-1-60, SSEA4 og AP flekker på dag 21.
Figur 1. Monitoring Fremskritts av Omprogrammering ved hjelp av flowcytometri. Flowcytometri Dot Tomter DF1 Fibroblaster omprogrammert til Sendai virus henhold Feeder frie betingelser. Cellene ble høstet og farget med SSEA4 og CD44 antistoffer på ulike intervaller fra Dag 3 (D3) til Dag 19 (D19) av omprogrammering prosessen. Kulturer ved dag 9 (D9) og utover ble analysert etter at cellene ble sådd på nytt på dag 7 (D7). Prikkplott viser 8000 sing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2. Evaluering Omprogrammering Kinetics og effektivitet i henhold Feeder frie betingelser (A) Diagram som viser endringer i andelen av SSEA4 + CD44 - omprogrammeres celler etter transducing DF1 fibroblasts og BJ fibroblaster med Sendai virus. Celler ble analysert ved flowcytometri ved dag 3-19 etter transduksjon, med kulturer ved dag 9 og utover gjennomgår reseeding på dag 7. (B) Pseudo-farge flowcytometri tomter for DF1 celler transduced Sendai virus og farget med SSEA4 og CD44 antistoffer. SSEA4 -. CD44 + celler (sort sirkel) og SSEA4 + celler (rød sirkel) ble sortert på dag 8 og lov til å vokse til dag 19 før farging for alkalisk fosfatase (rød) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Observing omprogrammering Kinetics av Feeder-fri kulturer ved hjelp av ulike positive og negative PSC Markører. (AD) Live-fargingav Dag-18 DF1-avledet omprogrammering kulturer som bruker antistoffer for de positive PSC markører CD24 og EpCAM og negative PSC markører CD44, CD73, og B2M. Den øverste panelene fusjonere de grønne og røde fluorescens kanaler mens bunnplatene har også fasekontrastrikt bilde. Målestokk representerer 200 mikrometer. (E) Flowcytometri dot tomter for DF1-avledet omprogrammering kulturer høstet og farget med de samme markører fra Dag 9-17 (D9 til D17) post-transduksjon. Før analyse kulturer ble reseeded på dag 7. Prikkplott viser 8000 sing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tracking omprogrammering Kinetics ved å måle Total Confluence. (A) i sanntid imaging av BJ fibroblaster omprogrammert til Sendai virus henhold mater frie forhold. Fase kontrast av samme kolonier ble tatt på dag 7-19, så i dag 21 med ekstra farging for CD44 og SSEA4, TRA-1-60 eller AP. Scale bar tilsvarer 400 mikrometer. (B) Kvantifisering av total samløpet (fase kontrast) som omprogrammering utvikler seg fra reseeding på dag 7 til dag 21. Totalt løpet på dag 21 er i forhold til SSEA4, TRA-1-60 og AP signal samløpet ( grønn kanal). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Vurdere Omprogrammering Kinetics ved å måle OCT4-GFP Confluence. (A) i sanntid avbildning av BG01v / HOG hESC-avledet fibroblaster omprogrammertSendai virus henhold mater frie forhold. Fase kontrast, grønn fluorescens og fusjonerte bilder av de samme kolonier ble generert på dag 7 til 19. Scale bar tilsvarer 400 mikrometer. (B) Kvantifisering av total samløpet (fase kontrast) og OCT4-GFP samløpet (grønn kanal) som omprogrammering utvikler fra re-seeding ved dag 7 til dag 21. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne [RHQ, JSTA, KS, og UL] er ansatte i Thermo Fisher Scientific, som produserer noen av reagenser og instrumenter som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Chad MacArthur for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
- Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
- Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
- Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
- Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
- Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
- Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
- Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
- Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).
