קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
במהלך ניתוחי עצם שיקומיים, כמויות supraphysiological של גורמי גדילה נטענות באופן אמפירי על פיגומים לקדם ואיחוי העצמה מוצלח. מינונים גבוהים של חומרים ביולוגיים חזקים מאוד נדרשים בשל חוסר יציבות גורמת גדילה כתוצאת שפלת אנזימטית מהירה כמו גם חוסר יעילות המוביל לאיתור כמויות מספיקות של גורם גדילה באתרי שתל. לפיכך, אסטרטגיות להאריך את היציבות של גורמי גדילה כגון BMP-2 / נל-1, ולשלוט שחרורם באמת יכול להפחית את המינון שלהם יעיל ובכך להפחית את הצורך במינונים גדולים יותר במהלך ניתוחים התחדשות העצם בעתיד. זה בתורו יפחית תופעות לוואי ועלויות גורם גדילה. פץ עצמית התאסף כבר מפוברקת כדי לספק שליטה טובה יותר של BMP-2 / נל-1 משלוח באמצעות הפרין פעילות ביולוגי גורם גדילה להגביר עוד יותר מחייב על ידי שיפור יציבות vivo. כאן אנו מדגימים את הפשטות של ייצור PEC אשר מסייעת deliveר"י של מגוון של גורמי גדילה במהלך ניתוחי עצם שיקומיים.
Introduction
תחולת pseudoarthrosis דווחה להיות גבוה ככל 10 עד 45% בניתוחים בעמוד השדרה היתוך השדרה ניווניות ותיקון 1. כדי להפחית את שיעור pseudarthrosis במהלך היתוך שדרה וניתוחי עצם שיקומיים אחרים, גורמי גדילת osteogenic כגון BMP-2, נל-1 1 ו גורם גדילה טסיות נגזר (PDGF) הוכנסו לקדם דה נובו osteogenesis. בין אלה, BMP-2 היא בחירה פופולרית עבור היתוך השדרה 2. למרות העוצמה של BMP-2 בזירוז והקלה היווצרות העצם החדש כבר מבוססת היטב 3; סיבוכים משמעותיים קליני כגון היווצרות עצם heterotopic, seroma היווצרות שטף דם, תגובה דלקתית, radiculitis, osteolysis גוף שדרה, שפיכה מדרדרת ממשיכים להיות בעיות של דאגה בשל כמויות supraphysiological בשימוש 4,5.
לכן, הוריד המינון של BMP-2 נשאר אסטרטגיה רלוונטית בביתמפתה כדי למזער תופעות לוואי. חוץ מזה, מערכות הספק יעילות נדרשות לדכא את שחרור הפרץ הראשוני של BMP-2 שנצפה מערכות ספק ספוג עכשווי קולגן נוסף לשיפור שירות ממושך המקומי של ציטוקינים זה חזק. השכבה-ידי שכבתי הרכבה העצמית לסירוגין polyelectrolytes קטיוני anionic יכולה להיות מועסקת כשיטה מתכוננת להקים מתחמי polyelectrolyte על פני השטח של מטריצות פיגום או חומרים מושתלים 6. מבחינה זו, הפרין (ידוע שיש צפיפות המטען השלילית הגבוהה ביותר של כל הגורמים הביולוגיים) הוכר לאגד בשקיקה עם מגוון רחב של גורמי גדילה באמצעות תחומים מחייבים אלקטרוסטטי הפרין. ואכן, הפרין הוכח להאריך את זמן מחצית החיים ובכך להגביר את הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה אחדים.
על בסיס זה, הקבוצה שלנו מותאמת פרוטוקול שכבה אחר שכבה הרכבה עצמית לפברק קומפלקס polyelectrolyte מבוסס הפרין (PEC) כי המון ומשמר את bioactivities של גורמי גדילה osteogenic במהלך קיבוע 7,8. ליבת microbead אלגינט היה מפוברק על ידי crosslinking α-L-guluronate (G) שאריות של אלגינט עם divalent קטיון יוני סידן או סטרונציום. ליבת אלגינט היא מטריצת פיגום מתכלה; אשר לאחר ההשתלה, הוא resorbed במיטה היתוך מתן מקום ingrowth הגרמי. פולי- L- ליזין (PLL) או protamine משמש כשכבת קטיוני כדי לשזור בשתי המטריצה הפיגום (במקרה זה, ליבת המוביל microbead אלגינט) ואת הפרין טעונים שלילית; בעוד שכבת פונקציות הפרין anionic לייצב בתרגום גורמי גדילה טעון. השכבה המשולשת PEC הוכחה להגדיל את קיבולת טעינה גורם גדילה במודל חזירי 9. לאחרונה, ספקי PEC הוכחו להפחית את המינון האפקטיבי בהצלחה של BMP-2 על ידי לפחות פי 20 חולדה 10 ומודלים חזיריים של היתוך שדרת 8.
ntent "> כאן אנו מדווחים שיטות פץ בודה למסירת גורם גדילה מוגברת היתוך שדרה ואת ניתוחי עצם שיקומיים האחרים באמצעות BMP-2 כגורם צמיחת osteogenic מודל.Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה לעריכת פץ דרך שכבה אחר שכבה הרכבה עצמית. שכבת-ידי שכבת המבנה דמיינו באמצעות אנלוגים הניאון של protamine, הפרין, BMP-2 ו נל-1 ו מיקרוסקופיה confocal. ספיגה ובדיקות לשחרר מראים כי הפרין על PEC מתווכת ספיגה ושחרור גורם גדילת osteogenic. היעילות הספיגה של שיטת PEC היא: נל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
