헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
재건 뼈 수술하는 동안, 성장 인자의 생리적 금액은 경험적으로 성공적으로 뼈 융합을 촉진하는 발판에로드됩니다. 매우 유력한 생물학적 제제의 많은 양이 급격한 효소 분해의 결과로서 성장 인자 불안정성뿐만 아니라 임플란트 부위에서의 성장 인자의 충분한 양의 국산화 캐리어 효율성에 요구된다. 따라서, 이들 릴리스 예컨대 BMP-2 / 넬-1과 성장 인자의 안정성을 연장하고, 제어 전략은 실제로 효과적인 투여 량을 낮출 수 있으며, 따라서 장래의 골 재생 수술시에 더 큰 용량의 필요성을 감소시킨다. 차례로 이것은 부작용 성장 인자 비용을 감소시킬 것이다. 자기 조립 농도 (PEC)는 생체 내 안정성을 향상시킴으로써 헤파린 결합 더욱 강화할 성장 인자의 생리 활성을 통해 BMP-2 / 넬 -1- 전달 나은 제어를 제공하기 위해 제작되었다. 여기에서 우리는 대인 수수 에이즈 PEC 제조의 단순성을 설명재건 수술 중에 뼈의 성장 인자의 다양한 RY.
Introduction
가관절 발생률은 퇴행성 척추 융합 및 개정 척추 수술 1에서 10 ~ 45 %로 높은 것으로보고되었다. 예컨대 BMP-2, 넬-1 및 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 등 골 형성 성장 인자가 새로이 골 형성을 촉진하기 위해 도입 된 척추 융합 등 재건 뼈 수술 중에 불유합의 속도를 감소시킨다. 이 중, BMP-2는 척추 융합 2 인기있는 선택입니다. 유도하고 새로운 뼈의 형성을 촉진 BMP-2의 효능이 잘 3 확립되었지만; 이러한 이소성 골 형성, 장액 및 혈종 형성, 염증 반응, radiculitis, 추체의 골 용해 및 역 행성 사정 등 임상 적으로 유의 한 합병증으로 인해 4,5 사용되는 생리적 양에 우려의 문제로 계속합니다.
따라서, BMP-2의 도즈를 낮추는 것은에서의 관련 전략을 유지부작용을 최소화하도록 유혹. 또한, 효율적인 캐리어 시스템은 BMP-2 현대 콜라겐 스폰지 캐리어 시스템에서 관찰되는 초기 파열 방출을 억제하여 더욱 강력한 사이토킨이 연장 된 및 국소 전달을 향상시키기 위해 필요하다. 양이온과 음이온 성 고분자 전해질을 교대의 층별 자기 조립은 지지체 매트릭스 또는 임플란트 재료 (6)의 표면에 고분자 전해질 복합체를 구축하는 동조 방법으로 사용될 수있다. 이러한 관점에서, (모든 생물학적 제제의 가장 높은 음의 전하 밀도를 갖는 알려진) 헤파린 열광적 정전 헤파린 결합 도메인을 통한 성장 인자의 다양한 바인딩 인식되었다. 실제로, 헤파린 반감기를 연장하고, 따라서 여러 가지 성장 인자의 생리 활성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다.
이를 바탕으로, 우리 그룹 헤파린 계 고분자 전해질 복합체 (PEC)을 제조하는 데 계층 별 자기 조립 층 프로토콜을 채택 하중 및 고정 7,8시 골 형성 성장 인자의 생리 활성을 유지합니다. 알지네이트 마이크로 비드 코어는 α-L-guluronate (G) 2가 양이온의 칼슘 또는 스트론튬 이온 알긴산 잔기를 가교 결합하여 제조 하였다. 알지네이트 코어는 생분해 성 지지체 매트릭스이고; 이는 이식 한 결과, 골 증식을위한 공간을 제공하는 융합 침대에서 재 흡수된다. 폴리 -L- 라이신 (PLL) 또는 프로타민 (이 경우, 알지네이트 마이크로 비드 담체 코어) 골격 매트릭스 및 음으로 하전 된 헤파린 모두 인터레이스 양이온 층으로서 사용된다; 음이온 성 헤파린 계층 기능은 안정화로드 성장 인자 국산화있다. 삼중 층 PEC는 돼지 모델 9 성장 인자 적재량을 증가시키는 것으로 나타났다. 최근 PEC 캐리어 성공적 쥐 10 척추 융합 8 돼지 모델에서 적어도 20 배 BMP-2의 유효 용량을 감소시키는 것으로 나타났다.
ntent는 "> 여기서는 모델 골 형성 성장 인자로서 BMP-2를 이용하여 척추 융합 향상된 성장 인자 전달 및 다른 골 재건술 실용 제조 페치 방법을보고한다.Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 층별 자기 조립을 통해 페치 제조 방법을 제공한다. 계층 별 구조는 층 프로타민, 헤파린, BMP-2와 넬-1과 초점 현미경 형광 유사체를 사용하여 가시화된다. 흡수 및 방출 시험은 PEC에 헤파린하는 골 형성 성장 인자 흡수 및 방출을 매개하는 것으로 나타났다. PEC 방법의 흡수 효율은 : 넬-1 : 86.7 ± 2.7 %, BMP-2 : 70.5 ± 3.1 %. PEC 캐리어 칼슘 아파타이트 입자 (40-80%) 11 순수한 표면 흡?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
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