Polyelektrolytkompleks for Heparin Binding Domain osteogene Growth Factor Levering
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Under rekonstruktiv bein operasjoner, er suprafysiologiske mengder av vekstfaktorer empirisk lastet på stillasene for å fremme vellykket bein fusion. Store doser av meget potente biologiske stoffer er nødvendig på grunn av vekstfaktor ustabilitet som et resultat av rask enzymatisk nedbrytning, så vel som bærer ineffektivitet i lokaliserende tilstrekkelige mengder av vekstfaktor ved implantatsteder. Derfor strategier som forlenger stabiliteten av vekstfaktorer så som BMP-2 / NELL-1, og kontrollere deres frigivelse kan faktisk redusere deres effektiv dose, og således redusere behovet for større doser under fremtidige benregenerering operasjoner. Dette i sin tur vil redusere bivirkninger og vekstfaktorer. Selv montert PEC er fabrikkert for å gi bedre kontroll med BMP-2 / NELL-en levering via heparin bindende og ytterligere forsterke vekstfaktor bioaktivitet ved å styrke in vivo stabilitet. Her viser vi enkelhet av PEC fabrikasjon som hjelpemidler i å levere denry av en rekke vekstfaktorer ved rekonstruktiv kirurgi bein.
Introduction
Forekomsten av pseudoarthrosis er blitt rapportert å være så høy som 10 til 45% i degenerativ spinal fusjon og revisjon spinal kirurgi 1. For å redusere frekvensen av pseudartrose under fremre fusjon og andre rekonstruktiv bein operasjoner, osteogene vekstfaktorer som BMP-2, Nell-1 1 og blodplater avledet vekstfaktor (PDGF) har blitt introdusert for å fremme de novo osteogenesis. Blant disse er BMP-2 et populært valg for spinal fusjon to. Selv om styrken av BMP-2 ved indusering og tilrettelegge ny bendannelse har blitt godt etablert 3; klinisk signifikante komplikasjoner som heterotop beindannelse, serom og hematomdannelse, betennelsesreaksjon, radikulitt, ryggvirvel kroppen osteolyse, og retrograd ejakulasjon fortsette å være saker av interesse på grunn av de suprafysiologiske beløp benyttet 4,5.
Derfor senke dosen av BMP-2 er fortsatt et relevant strategi vedfrister å minimalisere bivirkninger. Dessuten er effektive bæresystemer som kreves for å undertrykke den første serie utgivelsen av BMP-2 observert i moderne kollagen svamp bæresystemer og ytterligere forbedre langvarig og lokalisert levering av denne potente cytokin. Lag-på-lag selvbygging av alternerende kationiske og anioniske polyelektrolytter kan anvendes som en fleksibel fremgangsmåte for å bygge opp polyelektrolyttkomplekser på overflaten av stillas matriser eller implanterbare materialer 6. I denne forbindelse er heparin (kjent for å ha den høyeste negative ladningstetthet på alle biologiske faktorer) vært kjent for å begjærlig binde seg med en rekke vekstfaktorer via elektrostatiske og heparin-bindende domener. Faktisk har heparin er vist å forlenge halveringstiden og således forsterke bioaktiviteten av flere vekstfaktorer.
Basert på dette, vår gruppe tilpasset et lag-på-lag selv-montering protokollen for å dikte opp en heparin-baserte polyelektrolytkompleks (PEC) som belastninger og bevarer bioaktivitet av osteogene vekstfaktorer under immobilisering 7,8. Alginatet mikroperler Kjernen ble fremstilt ved tverrbinding av α-L-guluronate (G) rester av alginat med toverdig kation kalsium- eller strontiumioner. Alginatet kjerne er en bionedbrytbar matrise stillas; som etter implantering, er det resorberes i fusjons seng som gir plass for beninnvekst. Poly-L-lysin (PLL) eller protamin anvendes som kationiske laget for å sammenflettes med både stillaset matrise (i dette tilfellet, alginat mikrobæreren kjerne) og den negativt ladet heparin; mens de anioniske heparin laget virker til å stabilisere og lokalisere lastet vekstfaktorer. Trelags PEF har vist seg å øke vekstfaktor lastekapasitet i et svine-modell 9. Nylig har PEC bærere vist seg å kunne redusere den effektive dose av BMP-2 med minst 20 ganger hos rotte 10 og svinemodeller av spinal fusjon 8.
ntent "> Her rapporterer vi metoder for fabrikere PEC for økt vekstfaktor levering i spinal fusion og de andre rekonstruktiv bein operasjoner ved hjelp av BMP-2 som modell osteogene vekstfaktor.Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen presenterer en metode for fremstilling av PEC gjennom lag-på-lag selv-sammenstillingen. Lag-på-lag struktur er anskueliggjort ved hjelp av fluorescerende analoger av protamin, heparin, BMP-2 og NELL-1 og konfokal mikroskopi. Opptak og frigjøringsforsøkene viser at heparin på PEC formidler osteogene vekstfaktor opptak og utslipp. Opptaket effektiviteten av PEC-metoden er: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. PEF bæreren har en bedre modulasjon av NELL-1 (20%) frigjøring sammenlignet med en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
