Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Summary

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Abstract

Insgesamt ist T Zelladhäsion eine kritische Komponente der Funktion, einen Beitrag zu den unterschiedliche Prozesse der zellulären Rekrutierung von Entzündungsherden und die Wechselwirkung mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Bildung von immunologischen Synapsen. Diese beiden Kontexte T Zelladhäsion unterscheiden, daß T-Zell-APC-Interaktionen statisch betrachtet werden können, während T-Zell-Wechselwirkungen Blutgefß durch die Scherbeanspruchung durch Zirkulation selbst erzeugt werden, in Frage gestellt. T-Zellen-APC-Wechselwirkungen werden als statisch klassifiziert, dass in den beiden Zellpartnern sind statisch relativ zueinander. Normalerweise tritt diese Wechselwirkung innerhalb der Lymphknoten. Als eine T – Zelle mit der Blutgefäßwand in Wechselwirkung tritt, verhaften die Zellen und muss die erzeugte Scherbeanspruchung zu widerstehen. ^1,2 markieren Diese Unterschiede die Notwendigkeit einer besseren statischen Haftung und Haftung unter Strömungsbedingungen als zwei unterschiedliche regulatorische Prozesse zu verstehen. Die Regulation der T-Zell-Adhäsion am meisten werden kann kurz und bündig als con beschriebenTrolling die Affinitätszustand von Molekülen exprimiert auf der Zelloberfläche Integrin, und somit die Wechselwirkung von Integrinen mit den adhesion molecule-Liganden auf der Oberfläche der Zelle exprimiert Interaktion reguliert wird. Unsere aktuellen Verständnis der Regulation von Integrin Affinität Staaten kommt von häufig vereinfachend in vitro Modellsystemen. Der Test der Adhäsion Strömungsbedingungen unter Verwendung von hier ermöglicht folgenden Stimulus für die Visualisierung und genaue Quantifizierung von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit beschrieben. Eine Haftung unter Strömungs Assay kann auf Studien der Haftung angewendet werden Signalgebung innerhalb von T-Zellen nach der Behandlung mit inhibitorisch oder stimulatorisch Substanzen. Darüber hinaus kann dieser Test über T-Zell-Signalgebung auf jede Klebe Leukozytenpopulation und jedes Integrin-Adhäsionsmolekül Paar erweitert werden.

Introduction

T – Lymphozyten – Adhäsion vermittelt eine Anzahl verschiedener Prozesse in einem gesunden Immunsystem, ³ entscheidende Rolle bei der T – Zell – Handel und Antigenpräsentation spielen. Ob bei der Immunüberwachung oder eine aktive Immunantwort diese beiden Rollen breiten für die Haftung sind kritisch. ⁴ Die physiologischen Signalereignisse von T – Zell-Endothel-Interaktionen unterscheiden sich von T – Zell-Antigen – präsentierenden Zellen (APC) Wechselwirkungen und erfordern daher unterschiedliche Methoden Studie am besten verstehen, die signal~~POS=TRUNC beteiligt. Die feste Haftung einer T-Zelle zu einer Blutgefäßwand während der Lymphozyten-Extravasation erfordert eine schnelle und dynamische Integrin-Aktivierung. Die enge Wechselwirkung zwischen einem aktiven Zustand Integrin und Adhäsionsmoleküle entlang des Endothels führt zu beständige Haftung auf den Fluss von Blut, T – Zellen , so dass auf der Suche nach einer Fläche permissive Zellpassage entlang der Oberfläche zu kriechen. ⁵ Das Crawling einer T – Zelle bi -directionally Alonga Blutgefßwand ist angewiesen auf polarisierter Adhäsion, mit einem ausgeprägten Klebe vorderen Ende der T – Zelle. ⁶ Am wichtigsten ist, feste Adhäsion und Transmigration erfordern Widerstand gegenüber der Scherkraft , die durch den Blutfluss zirkuliert.

Wenn Experimente entwerfen Lymphozytenadhäsion zu studieren, sollten ihr Augenmerk auf den spezifischen Reiz von Zinsen gezahlt werden. Während Integrin-Aktivierung eine übliche und wichtige Komponente für alle Formen der T-Zell-Adhäsion, sind die Kaskaden von der Aktivierung wahrscheinlich einzigartig nachgeordnet einzelnen Rezeptoren und Co-Rezeptoren zu sein. Ebenso funktionieren Integrin und Adhäsionsmolekül-Paare in spezialisierten Mikroumgebungen und auf spezifische Subpopulationen. Auf diese Weise können diese Paare ganz anders geregelt werden. Das Modell präsentiert hier ist ideal für die Untersuchung von Signalkaskaden , die zu Integrin – Aktivierung unter Scherspannungsbedingungen nehmen. ⁷ Diese Wechselwirkungen können nicht adäquat in einem statischen ADHESI verstanden werdenauf System , um die Auswirkungen durch diese Kräfte direkt auf T – Zellen – Verhalten gezeigt haben , wurden. ⁸ Obwohl hier mit T – Zellen und CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen entwickelt , um menschliche ICAM-1 (CHO-ICAM – Zellen) exprimieren das System präsentiert werden , können leicht modifiziert werden, um verschiedene Leukozytenpopulationen oder Adhäsionsmoleküle zu untersuchen.

Dieser Test stellt ein Verfahren T-Zell-Klebrigkeit und Integrin-Aktivierung unter Verwendung von Scherspannung zu quantifizieren, ein Modell für die feste Haftung Stadium der Leukozytenextravasation bereitstellt. Durch die Verwendung von CHO-Zellen ICAM die Affinität von LFA-1 für seinen Liganden in lebenden Zellen können in Echtzeit in Reaktion auf verschiedene Stimuli von Interesse untersucht werden. Diese Technik erfordert einfach erhalten, im Handel erhältliche Mikroströmungskammern in Kombination mit einer Spritzenpumpe, stark die Ausrüstung vereinfacht notwendigen Durchblutung und Scherspannung im Vergleich zu anderen Modellen. ⁹ Ein weiterer großer Vorteil dieses Assays zu modellieren ist , dass spezifische SignalKaskaden und der resultierende Aktivierungszustand einzelner Integrine sauber durch die Verwendung von gentechnisch veränderten CHO-Zellen können menschlichen Adhäsionsmoleküle von Interesse exprimieren, untersucht. Darüber hinaus ist die Kombination von quantitativen Daten mit lebenden Zellen ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Insgesamt während eine Reihe von Tests der statischen T Zelladhäsion beschrieben wurden, die gut T-Zell-APC-Interaktionen zu modellieren, sind diese Modelle nicht ausreichend in den dynamischen Prozess der T-Zell-epitheliale Adhäsion zu erfassen. Aus diesem Grund wird, wenn ein Adhäsionstest der Reiz in Frage entscheiden müssen berücksichtigt werden.

Protocol

1. Auflage die CHO-Zellen ICAM Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die CHO-ICAM-Zellen in den Strömungskammern für das Wachstum über Nacht mit dem Ziel der Erzeugung einer konfluenten Monoschicht zu plattieren. Pflegen CHO-ICAM-Zellen in 10 cm Gewebekultur behandelten Kulturschalen in 10 ml RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (CHO-ICAM kompletten Kulturmedium) bei 37 ° C mit 5% CO 2. Um Zellen zu sammeln, 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA un…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse sind aus der Strömungs Adhäsionsassay gezeigt unter Verwendung von Jurkat und primären humanen CD3 + T – Zellen, wie angegeben, stimuliert mit SDF-1α. Die negativen Kontrollen in allen gezeigten Experimente sind nicht stimulierten Zellen. Ein Schwellenwert basal Prozent Anhaftung von nicht-stimulierten Zellen von 5 – 10%; Basis Haftung zeigt insbesondere eine problematische Experiment über diesem Bereich und schlägt vor, die Start Population vo…

Discussion

Um das Stimulans richtig T – Zell – Adhäsion zu analysieren, um in die Studie aufgenommen werden müssen berücksichtigt werden , wenn ein in vitro – Verfahren wählen. Zwar gibt es mehrere Assays sind Signale zu untersuchen, die zu LFA-1-Aktivierung und ICAM-1-Bindung Alle Methoden sind nicht austauschbar. Eine statische Adhäsionstest ¹⁰ ist am besten geeignet , T – Zell-APC – Wechselwirkungen zu untersuchen; alternativ detailliert die Schubspannung Methode hier ist ideal T – Zell-epithelialen Zel…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950