Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Summary

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Abstract

Em geral, a adesão de células T é um componente crítico da função, contribuir para os processos distintos de recrutamento celular para os locais de inflamação e a interacção com as células apresentadoras de antigénio (APC), na formação de sinapses imunológicas. Estes dois contextos de adesão celular T diferem em que T interações célula-APC pode ser considerado estático, enquanto interações dos vasos células T no sangue são desafiados pela tensão de cisalhamento gerada pela própria circulação. interacções célula T-APC são classificados como estático em que os dois parceiros celulares são estáticos em relação ao outro. Normalmente, esta interacção ocorre dentro dos nódulos linfáticos. Como uma célula T interage com a parede do vaso sanguíneo, as células de prender e devem resistir à tensão de cisalhamento gerada. ^1,2 Estas diferenças evidenciam a necessidade de compreender melhor a aderência estática e a aderência em condições de escoamento como dois processos reguladores distintos. A regulação da adesão das células T pode ser sucintamente descrito como conpesca à linha do estado de afinidade de integrina moléculas expressas na superfície da célula, e regulando assim a interacção de integrinas com os ligandos da molécula de adesão expressas na superfície da célula que interage. A nossa compreensão atual da regulação dos estados afinidade para a integrina vem muitas vezes simplista em sistemas modelo in vitro. O ensaio de adesão usando condições de fluxo descritos aqui permite a visualização e a quantificação precisa de interacções celulares de células-T epitelial em tempo real, na sequência de um estímulo. Uma adesão sujeito ao ensaio de fluxo pode ser aplicado a estudos de adesão de sinalização nas células T, após o tratamento com substâncias inibidoras ou estimuladores. Além disso, este ensaio pode ser expandido para além de sinalização de células T para qualquer população de leucócitos adesivo e qualquer integrina-molécula de adesão par.

Introduction

T medeia a adesão de linfócitos de um número de processos diferentes, em um sistema imunitário saudável, ³ desempenhando papéis críticos no tráfico de células T e a apresentação do antigénio. Se durante a vigilância imunitária ou uma resposta imunitária activa estas duas grandes funções de adesão são críticos. ⁴ Os eventos de sinalização fisiológicos de interacções de células de células do endotélio T são distintos de células T-célula que apresenta antigénios (APC) interacções, e, portanto, requerem métodos distintos de estudo para melhor compreender as cascatas de sinalização envolvidos. A adesão firme de uma célula T a uma parede do vaso sanguíneo durante o extravasamento de linfócitos requer activação rápida e dinâmica integrina. A interacção estreita entre uma integrina e adesão activas moléculas de estado ao longo do endotélio leva a aderência resistente ao fluxo de sangue, permitindo que as células T para rastrear ao longo da superfície em busca de uma área permissiva para a passagem de células. ⁵ O rastreamento de um bi células T -directionally Alonda parede do vaso sanguíneo GA é dependentes de adesão polarizada, com uma extremidade dianteira adesiva distinta da célula T. ⁶ Mais importante ainda, a adesão e transmigração firme requerem resistência à força de corte gerada pela circulação de fluxo sanguíneo.

Ao projetar experimentos para estudar a adesão de linfócitos, deve ser dada atenção ao estímulo específico de interesse. Enquanto a activação de integrina é um componente comum e crítica de todas as formas de adesão das células T, as cascatas de activação são susceptíveis de ser único a jusante dos receptores individuais e co-receptores. Do mesmo modo, pares de integrina e molécula de adesão funcionam em microambientes especializados e em subpopulações específicas. Desta forma, estes pares podem ser regulados de forma bastante diferente. O modelo aqui apresentado é ideal para o estudo da cascata de sinalização que levam à integrina ativação ocorrendo em condições de tensão de cisalhamento. ⁷ Essas interações não podem ser adequadamente compreendidas em um ADHESI estáticano sistema devido ao impacto ter sido mostrado que estas forças têm directamente no comportamento das células T. ⁸ Embora apresentado aqui com as células T e as células CHO (Ovário de Hamster Chinês) manipuladas para expressar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1, o sistema pode facilmente ser modificado para estudar diferentes populações de leucócitos ou moléculas de adesão.

Este ensaio proporciona um método para quantificar a aderência de células T e a activação da integrina utilizando tensão de corte, fornecendo um modelo para a fase de adesão firme dos leucócitos extravasamento. Através da utilização de células CHO-ICAM a afinidade de LFA-1 para o seu ligando em células vivas pode ser examinada em tempo real, em resposta a vários estímulos de interesse. Esta técnica requer facilmente obtida, câmaras de micro-fluxo disponíveis comercialmente em combinação com uma bomba de seringa, o que simplifica grandemente o equipamento necessário para modelar o fluxo sanguíneo e tensão de cisalhamento, em comparação com outros modelos. ⁹ Uma outra vantagem principal deste ensaio é que a sinalização específicacascatas e do estado de activação das integrinas resultante individuais podem ser estudados de forma limpa através da utilização de células CHO modificadas que expressam moléculas de adesão humanos de interesse. Além disso, a combinação dos dados quantitativos com imagem de células vivas é uma vantagem significativa do presente método. Em geral, embora um certo número de ensaios de adesão de células T estática ter sido descrito que bem modelar as interacções célula T-APC, estes modelos são insuficientes na captura do processo dinâmico de adesão celular epitelial-T. Por este motivo, quando a escolha de um ensaio de adesão do estímulo em questão deve ser considerado.

Protocol

1. plaqueamento das células CHO-ICAM Nota: O objectivo deste passo é a chapear as células CHO-ICAM nas câmaras de fluxo para o crescimento durante a noite com o objectivo de gerar uma monocamada confluente. Manter as células CHO-ICAM em 10 cm de cultura de tecidos tratados pratos de cultura de 10 ml de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM meio de cultura completo) a 37 ° C com 5% CO 2. Para recolher as cé…

Representative Results

Os resultados representativos são apresentados a partir do ensaio de adesão de Jurkat e de fluxo utilizando células T CD3 + humanos primária, tal como indicado, estimuladas com SDF-1α. Os controlos negativos em todas as experiências mostradas são células não estimuladas. Um limiar basal percentagem de adesão das células não estimuladas é entre 5 – 10%; adesão de base notadamente acima dessa faixa indica uma experiência problemática e sugere a população iníci…

Discussion

A fim de analisar adequadamente a adesão de células T, o estimulante seja incluída no estudo deve ser considerado na escolha de um método in vitro. Embora existam vários ensaios para estudar os sinais que conduzem a LFA-1 e ICAM-activação uma ligação todos os métodos não são intercambiáveis. Um ensaio de adesão estático ¹⁰ é o mais adequado para estudar as interações de células T-APC; Alternativamente, o método de tensão de corte detalhado aqui é ideal para modelar as interacç?…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950