टी लिम्फोसाइट-आसंजन अणु बातचीत का अध्ययन के लिए आसंजन के तहत कतरनी तनाव की परख
Summary
इस प्रवाह आसंजन परख टी सेल उपकला सेल बातचीत का एक सरल, उच्च प्रभाव मॉडल उपलब्ध कराता है। एक सिरिंज पंप कतरनी तनाव उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और confocal माइक्रोस्कोपी मात्रा का ठहराव के लिए छवियों कब्जा। इन अध्ययनों के लक्ष्य को प्रभावी ढंग से प्रवाह की स्थिति का उपयोग कर टी सेल आसंजन यों की है।
Abstract
कुल मिलाकर, टी सेल आसंजन सूजन और प्रतिरक्षा synapses के गठन में प्रतिजन कोशिकाओं (एपीसी) के साथ बातचीत की साइटों के लिए सेलुलर भर्ती के विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए योगदान, समारोह के एक महत्वपूर्ण घटक है। टी सेल आसंजन के इन दो संदर्भों, कि टी सेल एपीसी बातचीत स्थिर माना जा सकता है में मतभेद है, जबकि टी सेल की रक्त वाहिनियों की बातचीत परिसंचरण खुद के द्वारा उत्पन्न कतरनी तनाव से चुनौती दी है। टी सेल एपीसी कि बातचीत में स्थिर के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं दो सेलुलर भागीदारों एक दूसरे को स्थिर रिश्तेदार हैं। आमतौर पर, इस बातचीत लिम्फ नोड्स के भीतर होता है। एक टी सेल रक्त वाहिनियों की दीवार के साथ सूचना का आदान प्रदान के रूप में, कोशिकाओं को गिरफ्तार करने और उत्पन्न कतरनी तनाव का विरोध करना चाहिए। 1,2 इन मतभेदों को बेहतर दो अलग नियामक प्रक्रियाओं के रूप में प्रवाह शर्तों के तहत स्थिर आसंजन और आसंजन को समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला। टी सेल आसंजन के नियमन के सबसे संक्षेप चोर के रूप में वर्णित किया जा सकताकोशिका की सतह पर व्यक्त अणुओं इंटीग्रिन, और इस तरह आसंजन अणु बातचीत कोशिका की सतह पर व्यक्त ligands के साथ इंटेग्रिन की बातचीत को विनियमित करने की आत्मीयता राज्य trolling। हमारे इंटीग्रिन आत्मीयता के राज्यों के नियमन की वर्तमान समझ अक्सर इन विट्रो मॉडल प्रणाली में ही साधारण से आता है। आसंजन प्रवाह यहाँ वर्णित शर्तों का उपयोग करने की परख दृश्य और एक उत्तेजना के बाद वास्तविक समय में टी सेल उपकला सेल बातचीत की सही मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। प्रवाह परख के तहत एक आसंजन निरोधात्मक या उत्तेजक पदार्थ के साथ इलाज के बाद टी कोशिकाओं के भीतर संकेत आसंजन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। साथ ही, इस परख किसी भी चिपकने वाला ल्युकोसैट आबादी और किसी भी इंटीग्रिन आसंजन अणु जोड़ी को टी सेल संकेतन परे का विस्तार किया जा सकता है।
Introduction
टी लिम्फोसाइट आसंजन, एक स्वस्थ प्रतिरक्षा प्रणाली में विशिष्ट प्रक्रियाओं की एक संख्या में मध्यस्थता 3 टी सेल की तस्करी और प्रतिजन प्रस्तुति में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है। प्रतिरक्षा निगरानी या एक सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आसंजन के लिए इन दो व्यापक भूमिकाओं महत्वपूर्ण हैं दौरान या नहीं। 4 टी सेल endothelial सेल बातचीत के शारीरिक संकेत घटनाओं सेल पेश (एपीसी) बातचीत टी सेल प्रतिजन से अलग कर रहे हैं, और इसलिए की अलग तरीकों की आवश्यकता होती है अध्ययन सबसे अच्छा शामिल cascades संकेत समझने के लिए। लिम्फोसाइट परिस्त्राव के दौरान एक रक्त वाहिका दीवार के लिए एक टी सेल की फर्म आसंजन तेजी से और गतिशील इंटीग्रिन सक्रियण की आवश्यकता है। Endothelium साथ एक सक्रिय राज्य इंटीग्रिन और आसंजन अणुओं के बीच बातचीत तंग आसंजन रक्त के प्रवाह के लिए प्रतिरोधी की ओर जाता है, टी कोशिकाओं एक क्षेत्र सेल पारित होने के लिए अनुमोदक की तलाश में सतह के साथ क्रॉल करने के लिए अनुमति देता है। 5 एक टी सेल द्वि के रेंगने -directionally Alonगा रक्त वाहिनियों की दीवार ध्रुवीकरण आसंजन पर निर्भर है। टी सेल की एक अलग चिपकने वाला सामने अंत के साथ, 6 सबसे महत्वपूर्ण बात, फर्म आसंजन और स्थानांतरगमन कतरनी रक्त के प्रवाह में घूम द्वारा उत्पन्न बल के लिए प्रतिरोध की आवश्यकता होती है।
जब लिम्फोसाइट आसंजन का अध्ययन करने के प्रयोगों को डिजाइन, ध्यान हित के विशिष्ट प्रोत्साहन के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। जबकि इंटीग्रिन सक्रियण टी सेल आसंजन के सभी रूपों का एक आम और महत्वपूर्ण घटक है, सक्रियण के cascades अद्वितीय व्यक्ति रिसेप्टर्स और सह रिसेप्टर्स के बहाव होने की संभावना है। इसी तरह, इंटीग्रिन और आसंजन अणु जोड़े विशेष microenvironments में और विशिष्ट उप-जनसंख्या पर कार्य करते हैं। इस तरह, इन जोड़ों काफी अलग विनियमित किया जा सकता है। मॉडल यहाँ प्रस्तुत सक्रियण कतरनी तनाव की शर्तों के तहत जगह लेने के लिए अग्रणी इंटीग्रिन cascades संकेत के अध्ययन के लिए आदर्श है। 7 इन मुलाकातों पर्याप्त रूप से एक स्थिर adhesi में नहीं समझा जा सकतासिस्टम पर प्रभाव के कारण इन बलों टी सेल व्यवहार पर सीधे है दिखाया गया है। 8 हालांकि टी कोशिकाओं और चो (चीनी हैम्स्टर अंडाशय) कोशिकाओं मानव ICAM-1 (चो ICAM सेल) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर सिस्टम कर सकते हैं के साथ यहां प्रस्तुत आसानी से अलग ल्युकोसैट आबादी या आसंजन अणुओं का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जाना है।
इस परख कतरनी तनाव का उपयोग कर, ल्युकोसैट परिस्त्राव की फर्म आसंजन चरण के लिए एक मॉडल उपलब्ध कराने के टी सेल चिपचिपाहट और इंटीग्रिन सक्रियण यों तो एक तरीका प्रदान करता है। चो ICAM कोशिकाओं के उपयोग के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में अपने ligand के लिए LFA-1 की आत्मीयता हित के विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में वास्तविक समय में जांच की जा सकती है। इस तकनीक को आसानी से एक सिरिंज पंप के साथ प्राप्त की आवश्यकता है, संयोजन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्म प्रवाह कक्षों, बहुत उपकरणों रक्त प्रवाह और कतरनी तनाव मॉडल करने के लिए आवश्यक सरल बनाने के अन्य मॉडलों की तुलना में। 9 इस परख का एक अन्य प्रमुख लाभ यह है कि विशिष्ट संकेत हैझरने और व्यक्तिगत इंटेग्रिन के परिणामस्वरूप सक्रियण राज्य सफाई से इंजीनियर चो कोशिकाओं हित के मानव आसंजन अणुओं को व्यक्त करने के उपयोग के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जीना सेल इमेजिंग के साथ मात्रात्मक डेटा का संयोजन इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण लाभ है। कुल मिलाकर, स्थिर टी सेल आसंजन की assays के एक नंबर का वर्णन किया गया है, जबकि कि अच्छी तरह से टी सेल एपीसी बातचीत मॉडल, इन मॉडलों टी सेल उपकला आसंजन के गतिशील प्रक्रिया पर कब्जा करने में अपर्याप्त हैं। इस कारण से, जब एक आसंजन परख चुनने के सवाल में प्रोत्साहन विचार किया जाना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्रम में ठीक से टी सेल आसंजन का विश्लेषण करने के लिए, उत्तेजक अध्ययन में शामिल किया जा सकता है जब इन विट्रो विधि चुनने पर विचार किया जाना चाहिए। जबकि वहाँ LFA-1 सक्रियण और ICAM-1 बाइंडिंग के लिए अग्रणी संके?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
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