के लिए फीमर विंडो चैंबर मॉडल<em> Vivo</em> Murine अस्थि मज्जा में सेल ट्रैकिंग

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

अस्थि मज्जा एक महत्वपूर्ण hematopoiesis और प्रतिरक्षा विनियमन में शामिल अंग है। यह hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) युक्त एक hematopoietic घटक के होते हैं, और गैर hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं है कि mesenchymal कोशिकाओं ¹ को जन्म दे युक्त एक stromal घटक है। Hematopoietic गतिविधि के दो-तिहाई माइलॉयड कोशिकाओं ² की पीढ़ी के लिए समर्पित है। विशेष रूप से, न्यूट्रोफिल की एक बड़ी संख्या है, अस्थि मज्जा में उत्पादित कर रहे हैं के साथ 1-2 एक्स 10 ¹¹ कोशिकाओं को एक सामान्य वयस्क मानव ² में प्रति दिन उत्पन्न। न्यूट्रोफिल सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं और ज्यादातर अस्थि मज्जा में आरक्षित हैं जब तक तनाव परिधीय न्यूट्रोफिल ^1,3 के पूरक के लिए उनकी लामबंदी से चलाता है। उनके विरोधी माइक्रोबियल प्रभाव के अलावा, हाल के अध्ययनों बदलने के विकास पर निर्भर करता है कैंसर जीव विज्ञान में न्यूट्रोफिल की एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव है, दोनों के समर्थक और विरोधी tumorigenic phenotypes होनेकारक बीटा (TGF-β) ट्यूमर microenvironment ^4,5 में संकेत। इसके अलावा, अध्ययन प्रदर्शन किया है कि न्यूट्रोफिल कि प्राथमिक ट्यूमर में जमा है, टी कोशिकाओं ^6.7 की साइटोटोक्सिक समारोह दबा द्वारा समर्थक tumorigenic और मेटास्टेटिक प्रभाव डालती है, जबकि संचलन में न्यूट्रोफिल एक साइटोटोक्सिक, विरोधी मेटास्टेटिक प्रभाव ⁸ डालती है। जैसे, अस्थि मज्जा में hematopoietic कोशिकाओं, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल, की जांच के प्रतिरक्षा और ट्यूमर नियमन में उनकी भूमिका elucidating के लिए महत्वपूर्ण है।

ऊतकविकृतिविज्ञानी और एक पूरा परिधीय रक्त गणना नियमित रूप से अस्थि मज्जा ⁹ में सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, इन तरीकों ही अलग सेल आबादी या ऊतक microstructures के स्थिर जानकारी प्रदान करते हैं। Vivo इमेजिंग में अनुदैर्ध्य सेल करने वाली सी के रूप में रूप में अच्छी तरह कई सेलुलर, नाड़ी और stromal घटकों की गतिशीलता का आकलन करने के लिए मानक तरीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकताएक अनुदैर्ध्य ढंग से पक्ष बातचीत। Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM), सूक्ष्म संकल्प ¹⁰ पर जानवरों के रहने की इमेजिंग के रूप में परिभाषित करते हैं, वही नमूने में समय के साथ गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक जानवर की संख्या को कम करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। IVM अक्सर महीने के लिए सप्ताह की अवधि खत्म हो इमेजिंग के लिए ब्याज की अंग पहुँचने के लिए एक लंबे समय से प्रत्यारोपित खिड़की कक्ष (WC) के साथ संयुक्त है। कपाल और पृष्ठीय skinfold WC मॉडल वापस 1990 के दशक में वापस डेटिंग उपयोग की सबसे लंबे समय तक का इतिहास है। हाल ही में, अन्य अंग विशेष तरह के स्तन वसा पैड और विभिन्न पेट अंगों के उन लोगों के रूप में WC मॉडल ¹¹ विकसित किया गया है।

विवो में अस्थि मज्जा इमेजिंग के लिए विशिष्ट दृष्टिकोण चूहों के calvaria, जहां पतला अस्थि शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप कम से कम ^12-14 के साथ एकल कक्षों के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए सक्षम बनाता है की मुख्य रूप से शामिल जोखिम है। हालांकि, calvarial अस्थि मज्जा ख सकता हैई, ऐसे लंबी हड्डी के रूप में अन्य हड्डियों, उस से अलग रूप में calvaria में HSPCs और hypoxic कोशिकाओं का एक कम संख्या है, जो HSPCs ¹⁵ के रखरखाव और विकास के लिए कम इंगित करता है के द्वारा प्रदर्शन किया। इसलिए, लंबी हड्डी में सेलुलर घटकों का आकलन करने के लिए वैकल्पिक तरीकों जांच की गई है। ये ऊरु अस्थि मज्जा ^{16 वर्ष} की प्रत्यक्ष निवेश और पृष्ठीय skinfold WC ¹⁷ में विभाजन फीमर के अस्थानिक प्रत्यारोपण शामिल हैं। हालांकि, पूर्व में एक टर्मिनल प्रक्रिया है कि अब समय अवधि खत्म, सेलुलर संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन की ट्रैकिंग की अनुमति नहीं देता है, और बाद होने की संभावना पृष्ठीय skinfold WC के अंदर एक अस्थानिक साइट के लिए फीमर के प्रत्यारोपण के कारण सामान्य अस्थि मज्जा समारोह आ रही है। एक अन्य विधि समय के साथ ऊरु अस्थि मज्जा का ओर्थोटोपिक सीरियल इमेजिंग सक्षम बनाता है कि ऊरु हड्डी में एक शौचालय का इस्तेमाल होता है। एक पिछली रिपोर्ट ऊरु अस्थि मज्जा में microcirculation के दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन किया एक का उपयोग करचूहों ¹⁸ में WC फीमर। इसके अतिरिक्त, लेखकों फीमर में ट्यूमर कोशिकाओं के दृश्य का प्रदर्शन किया, निगरानी अस्थि मज्जा मेटास्टेसिस में इसकी उपयोगिता का संकेत है। हालांकि, इस WC डिजाइन अपने बड़े आकार (1.2 सेमी व्यास) और अपेक्षाकृत छोटे इमेजिंग क्षेत्र (4 मिमी व्यास), जो बड़े चूहों (26-34 जी, उम्र के 3-6 महीने) के लिए ही उपयुक्त था द्वारा सीमित था जिससे नियमित प्रयोग के लिए अव्यावहारिक दृष्टिकोण।

इसलिए, और एक छोटे समग्र आकार के साथ एक नया WC बड़ा आंतरिक इमेजिंग क्षेत्र इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए डिजाइन किया गया था। इस अध्ययन का लक्ष्य विभिन्न प्रकार के सेल इमेजिंग ऊरु अस्थि मज्जा में एक विधि के लिए प्रदान किया गया। फीमर WC मॉडल घर में विकसित किया गया था और 3 डी संवहनी नेटवर्क के भीतर कल्पना और न्यूट्रोफिल ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस मॉडल का उपयोग करना, अस्थि मज्जा का IVM 40 दिनों में क्रमानुसार किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण hematopoiesis की प्रक्रियाओं elucidating, प्रतिरक्षा विनियमन एक के लिए क्षेत्र की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकताएन डी ट्यूमर के विकास।

Protocol

नोट: सभी जानवर काम प्रोटोकॉल # 2615 विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के तहत बाहर किया गया था। 1. माउस की शल्य चिकित्सा की तैयारी सर्जरी से पह?…

Representative Results

Murine ऊरु अस्थि मज्जा को सफलतापूर्वक अलग-अलग न्यूट्रोफिल और संवहनी नेटवर्क के दृश्य सक्षम करने के लिए WC का उपयोग कर पहुँचा है। चित्रा 1 WC साधन पता चलता है और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया ह?…

Discussion

वास्तविक समय, अस्थि मज्जा में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के सीरियल इमेजिंग जानकारी है कि अन्यथा ऐसे ऊतक विज्ञान और कुल रक्त की गिनती के रूप में पारंपरिक तकनीक का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए चुनौती दे ?…

Materials

NRCNU-F athymic nude mice	Taconic	Ncr nude	8-10 weeks old, female
Saline	Baxter	JB1302P
Ketamine hydrochloride	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
Xylazine	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
Surgical drape	Proxima	DYNJP2405
Electric heating pad	Life Brand	57800827375
Stereomicroscope	Leica	Leica M60
Eye ointment (tear gel)	Novartis	T296/2
7.5% betadine	Purdue Frederick Co	67618-151-16
70% isopropyl alcohol	GreenField	P010IP7P
10% betadine	Purdue Frederick Co	67618-150-05
Scalpel handle (#3)	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blade (#15)	VWR	89176-368
Spring Scissors curved	Fine science Tools	15023-10
Baby-Mixter Hemostat	Fine science Tools	13013-14
Fine Scissors	Fine science Tools	14094-11
Extra Fine Graefe Forceps	Fine science Tools	11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats	Fine science Tools	13008-12
Micro-drill	Harvard Apparaus	72-6065
Micro-drill burrs	Fine Science Tools	19007-14
Femur window chamber	PMCC machine shop	custom design	9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar	PMCC machine shop	custom design	13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm)	Warner Instruments	HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm)	ACKLANDS GRAINGER	UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel)	Fastenal	70701
Dental cement	3M	RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black)	Covioien	SN-5698
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12501-13
Buprenorphine (Temgesic)	Reckitt Benckiser	DIN 0281251
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim	DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox)	Pfizer	DIN 02027879
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)	eBioscience	17-9668
Two-photon microscope LSM 710	Carl Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage	PMCC machine shop	custom design	15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software	Bitplane	Imaris 8.0	Image analysis software described in Section 3 of the Protocol
Zen 2012	Zeiss	Zen 2012	Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol