We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Telomere schützt Chromosomenenden von anomalen Fusion und Abbau. Mammalian Telomer besteht aus G-reichen hexameren wiederholt, TTAGGG und Shelterin Komplexe. Die telomere Wiederholungssequenz des Nematoden ist ähnlich zu denen von Säugetieren (TTAGGC). Die meisten Eukaryoten nutzen Telomerase Telomerwiederholungen zu ihrer chromosomalen Enden hinzufügen. Allerdings, 10 – 15% der Krebszellen nutzen Telomerase unabhängigen Mechanismus, bekannt als Alternative Verlängerung von Telomeren (ALT) 3. Zuvor berichteten wir , dass Telomerwiederholungen und die damit verbundenen Folgen, wie TALT genannt, in den Telomeren der Telomerase Mutantenlinien verstärkt wurden , die zwei kritische Sterilität überlebt.
Telomerlänge wurde durch quantitative PCR oder durch Southern – Blot gemessen, die 4,5,6,7 durchschnittliche Länge von insgesamt Telomere zur Verfügung stellt. Lesen Anzahl der Telomer – Repeat in Genomsequenzierungsdaten ist auch ein Indikator für insgesamt Telomer Inhalt 8. Obwohl Single Telomerlänge Analysis (STELA) könnte die Länge eines einzelnen Telomere liefern, es 9 räumliche Informationen der Telomere nicht zur Verfügung stellen kann. Während POT-1 :: mCherry Reporterprotein die räumliche Information der Telomere in vivo liefert, kann sie nicht Längen von doppelsträngigen Telomere darstellen, als POT-1 ein Einzelstrang ist Telomer – bindendes Protein 10.
Während zuvor genannten Verfahren der gemittelten Daten von repetitiven Sequenzen bereitzustellen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht , die Menge und räumlichen Muster von individuellen Sequenzen von Interesse auf einer chromosomalen Skala zu beobachten. Anstelle der Reinigung von DNA werden Gewebe oder Zellen fixiert die native räumliche Informationen in FISH zu bewahren. Somit ist FISH eine sowohl quantitative als auch qualitative Werkzeug zur Beobachtung der einzelnen Wiederholungssequenzen, wie beispielsweise Telomerwiederholungen.
Dieses Protokoll liefert ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Nachweis beider teloC. bloße und andere Wiederholungen von zuvor beschriebenen Methoden 11,12 auf Verbesserungen basieren. elegans Larven oder Erwachsene sind vielzelligen Organismus mit hoch differenzierten Zellen. Die Heterogenität von Zellen hemmt auf die quantitative Analyse einer großen Anzahl von Telomer Flecken. Um die Anzahl der analysierten Zellen zu maximieren, Embryonen isoliert und verteilt auf die Polylysin-beschichteten Objektträger für die Fische. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch mit Immunofluoreszenz kombiniert werden.
Als Beweis dafür, dass das Protokoll funktioniert, zeigen wir, dass es möglich ist, zwei unterschiedliche repetitive Sequenzen zu beobachten und zu quantifizieren. DNA-Sonde gegen TALT1 wurde erzeugt mit einfachen PCR-Digoxigenin-dUTP enthält. Dann ist diese TALT1 Sonde und Fluoreszenz-markierten Telomere PNA-Sonde wurden gleichzeitig hybridisiert. Anschließend wurde Digoxigenin durch kanonische Immunofluoreszenz Methoden nachgewiesen. Wir stellen Ihnen hier die repräsentativen Bilder , in denen TALT1 mit der Telomere in trt-1 kolokalisiert </em> Überlebenden.
Der Hauptvorteil unserer Protokolls ist die Einfachheit des Verfahrens ohne nennenswerte Beschädigung der Morphologie der Zellstruktur. Wurden mehrere Schritte für C optimiert elegans FISH in diesem Protokoll. Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche FISH umfassen Kennzeichnung von Sonden, die Fixierung von Embryonen und Penetration. Digoxigenin-dUTP Markierungsverfahren bietet eine einfach zu bedienende Markierungsverfahren durch PCR oder Nick-Translation. Zur Kennzeichnung wird lange Ziel…
The authors have nothing to disclose.
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
PNA probe | PANAGENE | custom order | |
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
Methanol | Carlo Erba | ||
Acetone | Carlo Erba | ||
Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
Razor | Feather | blade No. 11 | |
Rnase A | Enzynomics | ||
BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
Equipments | |||
Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |