Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной<em> В Ситу</em> Гибридизация (FISH) с зондами PNA<em> Caenorhabditis Элеганс</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Теломер защищает хромосомные концы от аномальным слияния и деградации. Млекопитающим теломер состоит из G-богатых гексамерных повторами, TTAGGG и shelterin комплексов. Последовательность теломер повторение нематода аналогичны млекопитающих (TTAGGC). Большинство эукариоты используют теломеразы, чтобы добавить теломер повторы к их хромосомными концами. Тем не менее, 10 – 15% раковых клеток используют теломеразы независимый механизм, известный как альтернативной удлинению теломер (ALT) ^3. Ранее мы сообщали , что теломер повторы и связанные с ней последовательности, названные в качестве Talt, были усилены в теломер теломераза мутантных линий , которые пережили критический стерильность ^2.

Длина теломер была измерена с помощью количественной ПЦР или с помощью саузерн – блоттинга, что обеспечивает среднюю длину теломер общего ^4,5,6,7. Прочитайте подсчет теломер повтора в целом данных секвенирования генома также является индикатором общего содержания теломер ^8. Хотя Sinгле длину теломер Анализ (STELA) может обеспечить длину одной теломеры, она не может обеспечить пространственную информацию теломер ^9. В то время как ПНТ-1 :: mCherry репортер белка обеспечивает пространственную информацию теломер в естественных условиях, он не может представлять длину двухцепочечных теломер, как и ПНТ-1 является одноцепочечной теломер – связывающего белка ^10.

В то время как вышеупомянутые методы дают усредненную информацию повторяющихся последовательностей, флуоресцентная гибридизация (FISH) в позволяет наблюдать количество и пространственное распределение отдельных последовательностей , представляющих интерес на хромосомном уровне. Вместо очистки ДНК, ткани или клетки закрепляются, чтобы сохранить нативную пространственную информацию в рыбе. Таким образом, рыба является как количественный и качественный инструмент для наблюдения отдельных последовательностей повторов, таких как теломер повторяется.

Этот протокол обеспечивает эффективный способ для одновременного обнаружения как Teloпростые и другие повторы на основе улучшения из ранее описанных методов ^11,12. C. личинки Элеганс или взрослые многоклеточный организм с высоко дифференцированных клеток. Неоднородность клеток препятствует на количественном анализе большого числа теломер пятен. Для того, чтобы максимально увеличить количество клеток, проанализированных, эмбрионы изолированы и распространяются на полилизиновых покрытые слайдами для рыб. Кроме того, этот протокол также может быть объединен с иммунофлюоресценции.

В качестве доказательства того, что работает протокол, мы покажем, что можно наблюдать и количественно две различные повторяющиеся последовательности. ДНК-зонд против TALT1 был сгенерирован с помощью простых ПЦР включения дигоксигенином дУТФ. Затем этот TALT1 зонд и флуоресцентно-меченного теломер ПНА зонд гибридизировали одновременно. Впоследствии дигоксигенина обнаружен каноническим методами иммунофлюоресценции. Мы представляем здесь репрезентативные изображения , где TALT1 локализуется с теломер в ТРТ-1 </eм> выжившие.

Protocol

1. этикетировочные Зонды с дигоксигенином дУТФ методом ПЦР Выполните ПЦР – мечение с 10x дНТФ смесь , содержащая дигоксигенином дУТФ , как описано выше 13. Очищают ПЦР-продукта с очисткой спин-колонки в соответствии с инструкцией изготовителя. Если зонд короче, чем 200 п…

Representative Results

Ранее сообщалось , что ALT выживших может выйти из теломераза-дефицитных мутантов, ТРТ-1 (ok410), на низкой частоте Реплицируя внутренне локализован 'Шаблон ALT' (Talt) последовательности для поддержания теломер 2. Использование ПНК зонда, мы смогли визуализирова…

Discussion

Основным преимуществом нашего протокола является простота процедуры без заметного ущерба морфологии клеточной структуры. Несколько шагов были оптимизированы для C. Элеганс FISH в этом протоколе. Критические шаги для успешного рыбы включают маркировку зондов, фиксация эмбрионов и …

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502