Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

Summary

Njurskador som uppstår från nephrotoxins, som omfattar läkemedel som sträcker sig från antibiotika till kemoterapeutika kan leda till komplexa sjukdomar vars patogenes förblir ofullständigt förstådd. Detta protokoll visar hur zebrafisk kan användas för sjukdom modellering av dessa villkor, som kan tillämpas på identifiering av renoprotective åtgärder.

Abstract

Njurarna är känsliga för skada från exponering för kemikalier de filtrerar från blodet. Detta kan leda till organskada i samband med en snabb nedgång i njurfunktion och utveckling av den kliniska syndrom som kallas akut njursvikt (AKI). Farmakologiska medel som används för att behandla medicinska förhållanden som sträcker sig från bakteriell infektion till cancer, när den administreras enskilt eller i kombination med andra läkemedel, kan initiera AKI. Zebrafisk är en användbar djurmodell för att studera kemiska effekter på njurfunktionen in vivo, eftersom de utgör en embryonal njure består av nephron funktionella enheter som är konserverade med högre ryggradsdjur, inklusive människan. Vidare kan zebrafisk användas för att utföra genetiska och kemiska skärmar, som ger möjligheter att belysa de cellulära och molekylära aspekter av AKI och utveckla terapeutiska strategier såsom identifiering av njurskyddande molekyler. Här visar vi hur mikroinjektion izebrafisk embryo kan utnyttjas som ett paradigm för njurskador studier.

Introduction

AKI är en abrupt förlust av njurfunktion som kan leda till förödande konsekvenser för hälsan ^1. AKI är en viktig hälsovård fråga över hela världen på grund av dess höga förekomsten av cirka 20% bland inneliggande patienter, med ännu högre hastigheter av 30-50% i kritiska fall vård och äldre, och dödligheten hos 50-70% ^1-3. Tyvärr har förekomsten av AKI ökat och förväntas att eskalera ytterligare under det kommande årtiondet, delvis beroende på de olika faktorer som kan inducera AKI, som omfattar postoperativ stress, ischemi, och exponering för nephrotoxins såsom antibiotika och kemoterapeutiska läkemedel ^4.

AKI innebär plötslig cellskador i njuren, vanligt förekommande i nefroner, som är de viktigaste funktionella enheter, och består av ett blodfilter och en segmenterad tubuli som dränerar urin i centrala uppsamlingsledningar ^1. När ett stort antal nefroner ärskadats under AKI, de omedelbara effekterna inkluderar ett avbrott i clearance avfall från cirkulationen och minskas eller upphävs vätskeflöde genom nephrons på grund av obstruktion från döda och döende celler ^1. Med tiden kan rörformiga hinder leda till degeneration av hela nefroner, som permanent minskar njurfunktionen ^en. Fysiologiska förändringar i njuren efter AKI innebär också komplexa inflammatoriska händelser som kan leda till kronisk ärrbildning ^en.

Trots dessa resultat, nefroner har viss förmåga att genomgå återhämtning efter AKI som återskapar den rörformiga epitel ^5,6. Även om det har varit en ökande molekylär förståelse av nephron regenerering, mekanismerna förblir svårfångade i många avseenden och kräver fortsatt utredning ^7. Den grad i vilken AKI resulterar i permanent njurskada är också fortfarande okänd. Aktuell forskning föreslår den regenerativa potential för njuren är denhögsta efter mindre allvarliga fall av AKI, medan mer uttalade eller upprepade episoder leda till kronisk njursjukdom (CKD) och kulminerar i terminal njursjukdom (ESRD) som kräver livräddande transplantation eller dialys ^8,9. Dessutom, personer som redan lider av CKD löper ännu större risk att smittas av en allvarlig episod av AKI ^8,9. Sammantaget är det uppenbart att en fortsatt grundforskning och klinisk forskning är viktigt att förstå, behandla och förebygga AKI.

Forskning med djurmodeller har varit avgörande för att uppskatta utvecklingen av lokala och miljöförändringar som inträffar under AKI ^10. För att utvidga denna förståelse samt utveckla nya terapier, har zebrafisk djurmodell använts i en mängd olika sätt ^11,12. Nephrons av zebrafisk njure, i både embryot och vuxna, visar en hög grad av bevarande med däggdjur ^13-16. Vidare, nephron epitel skada i zebrafish liknar processen i högre ryggradsdjur, varvid den lokala förstörelse av tubulära celler följs av Intratubulär spridning och återupprättande av nephron arkitektur ^17-19. I embryot är emellertid omfattande tubuli skador från de nephrotoxins såsom cisplatin associerade med letalitet ^20,21. Som jämförelse, zebrafisk vuxna överleva AKI och uppvisar materiella regenerativa kapacitet i njuren. Till exempel, efter exponering för aminoglykosidantibiotika gentamicin, zebrafisk regenerera tubuli epitelskada och växa nya nefronenheter samt ^22-24. Även om dessa gentamicin-inducerad AKI studier har gett värdefull information, att förstå njurskada från olika nephrotoxins förblir avgörande för att uppskatta effekterna och svar på olika typer av skador ^25.

Zebrafisk embryo, på grund av sin storlek, transparens, och genetisk spårbarhet, har många fördelar för njurskador studier <sup> 25, där metoden för mikroinjektion ^20,21 används för att administrera molekylen (er) för utredning. Nefroner bildas med 24 timmar efter befruktning (HPF) och börjar att filtrera blodet med cirka 48 HPF ^26,27. Således, den snabba bildningen och funktionen av den embryonala njur underlättar experimentell analys. Men processen för mikroinjektion har tekniska utmaningar och det kan vara en brant inlärningskurva att behärska tekniken. I denna video artikeln beskriver vi hur du utför microinjections och ge felsökningstips för att öka graden av framgångsrika injektioner.

Protocol

Procedurerna för att arbeta med zebrafisk embryon som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame. 1. Beredning av lösningar Gör en 50x stamlösning av E3 embryo media genom att blanda 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 och 9,95 g MgSO 4 i 5 L av destillerat vatten, och förvara vid RT. För odling av zebrafisk embryon, späda 50x stamlösning av E3 embryo media lager till en 1x arbe…

Representative Results

En mikroinjektion station inrättas inkluderar en stereo, mikromanipulator och tryckregulator (Figur 1A). Genomlysning av insprutningsplattan är att föredra att se prover under denna procedur (Figur 1B). Framställning av injektionsnålen involverar att dra den lämpliga borsilikatglas, följt av framställning av den kant med skärande och slutligen back-loading nålen. Optimalt är nålspetsen avfasade snarare än trubbiga (Figur 1C),</strong…

Discussion

Ett varierat antal terapeutiska medel har förknippats med AKI ^29. Det har skett betydande forskningsframsteg att förstå den skada som induceras av många enskilda föreningar, såsom aminoglykosiden gentamicin ³⁰ och används i stor utsträckning kemoterapeutiska cisplatin ^31,32. Vissa patologiska förändringar som är involverade i dessa villkor är dock fortfarande föremål för pågående studien. En framväxande utmaningen är fortfarande att förstå hur flera läkemedel påver…

Materials

Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60mm x 15mm	VWR	25373-085
100mm x 15mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150mm x 15mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24