Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Summary

Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Abstract

Los riñones son susceptibles al daño causado por la exposición a los productos químicos que se filtran desde el torrente sanguíneo. Esto puede conducir a una lesión de órganos asociada con una rápida disminución de la función y el desarrollo del síndrome clínico conocido como lesión renal aguda (IRA) renal. Los agentes farmacológicos utilizados para tratar las circunstancias médicas que van desde la infección bacteriana con el cáncer, cuando se administra individualmente o en combinación con otros fármacos, pueden iniciar AKI. El pez cebra son un modelo animal útil para estudiar los efectos químicos sobre la función renal in vivo, ya que forman un riñón embrionario compuesta de unidades funcionales de nefrones que se conservan con los vertebrados superiores, incluidos los humanos. Además, el pez cebra puede utilizarse para realizar cribados genéticos y químicos, que proporcionan oportunidades para dilucidar los aspectos celulares y moleculares de AKI y desarrollar estrategias terapéuticas tales como la identificación de moléculas nefroprotectores. Aquí, demostramos como la microinyección en elembrión de pez cebra puede ser utilizado como un paradigma para estudios nefrotoxina.

Introduction

AKI es una pérdida abrupta de la función renal que puede conducir a consecuencias devastadoras para la salud ^1. AKI es un problema importante de la salud en todo el mundo debido a su alta incidencia de aproximadamente el 20% de los pacientes hospitalizados, con tasas aún mayores de 30-50% en los casos de cuidados críticos y los ancianos, y las tasas de mortalidad de 50-70% ^1-3. Desafortunadamente, la prevalencia de la LRA ha ido en aumento y se prevé que agravar más durante la próxima década, debido en parte a la diversidad de factores que pueden inducir lesión renal aguda, que incluyen el estrés post-operatorio, la isquemia, y la exposición a nefrotoxinas tales como antibióticos y fármacos quimioterapéuticos ^4.

AKI implica daño celular súbita en el riñón, que se producen comúnmente en las nefronas, que son las unidades funcionales esenciales, y se componen de un filtro de sangre y un túbulo segmentado que drena la orina en los conductos colectores centrales ^1. Cuando un número significativo de nefronas sondañado durante AKI, los efectos inmediatos incluyen una interrupción en el aclaramiento de residuos de la circulación, y el flujo de fluido reducida o abrogada través de nefronas debido a la obstrucción de las células muertas y moribundas ^1. Con el tiempo, la obstrucción tubular puede conducir a la degeneración de las nefronas enteras, lo que reduce de forma permanente de la función renal ^1. Alteraciones fisiológicas en el riñón siguientes AKI también implican complejos eventos inflamatorios que pueden conducir a la cicatrización crónica ^1.

A pesar de estos resultados, las nefronas tienen cierta capacidad para someterse a la regeneración después de la IRA que reconstituye el ^5,6 epitelio tubular. Si bien ha habido una comprensión cada vez mayor de la regeneración molecular nefrona, los mecanismos sigue siendo difícil en muchos aspectos y fuese necesario prolongar la investigación ^7. El grado en que los resultados de AKI en el daño renal permanente También se desconoce. La investigación actual sugiere el potencial regenerativo para el riñón es elmás alta después de los casos menos graves de AKI, mientras que los episodios más pronunciados o repetidas conducen a la enfermedad renal crónica (ERC) y culminar en la enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) que requiere el trasplante o diálisis ^8,9 para salvar vidas. Además, las personas que ya sufren de enfermedad renal crónica corren un riesgo aún mayor de contraer un episodio grave de lesión renal aguda ^8,9. Tomados en conjunto, está claro que continuó la investigación básica y clínica es vital para entender, tratar y prevenir la IRA.

La investigación con modelos animales ha sido fundamental en la apreciación de la progresión de las alteraciones locales y ambientales que se producen durante AKI ^10. Para ampliar esta comprensión, así como desarrollar nuevas terapias, el modelo animal de pez cebra se ha empleado en una variedad de maneras ^11,12. Las nefronas del riñón pez cebra, tanto en el embrión y de adultos, muestran un alto grado de conservación con mamíferos ^13-16. Además, la lesión epitelial nefrona en zebrafish se asemeja al proceso en los vertebrados superiores, por lo que la destrucción local de células tubulares es seguida por la proliferación intratubular y el restablecimiento de la arquitectura de nefronas ^17-19. En el embrión, sin embargo, grandes daños túbulo de las nefrotoxinas tales como cisplatino está asociada con letalidad ^20,21. En comparación, el pez cebra adultos sobreviven AKI y exhiben capacidades regenerativas de fondo en el riñón. Por ejemplo, tras la exposición a la gentamicina antibiótico aminoglucósido, pez cebra regenerar daño epitelial túbulo y crecer nuevas unidades de nefrones, así ^22-24. Si bien estos estudios AKI gentamicina inducida han proporcionado valiosa información, la comprensión de daño renal de diversas nefrotoxinas sigue siendo fundamental para apreciar los efectos y la respuesta a los diferentes tipos de daños ^25.

El embrión de pez cebra, debido a su tamaño, la transparencia y la trazabilidad genética, tiene muchos beneficios para los estudios nefrotoxina <sup> 25, donde se utiliza el método de microinyección ^20,21 para administrar la molécula (s) para su investigación. Nefronas están formados por 24 h después de la fecundación (HPF) y empiezan a filtrar la sangre en aproximadamente un 48 HPF ^26,27. Por lo tanto, la rápida formación y la función del riñón embrionario facilita el análisis experimental. Sin embargo, el proceso de microinyección tiene desafíos técnicos y no puede haber una curva de aprendizaje para el dominio de la técnica. En este artículo de vídeo, se describe cómo realizar microinyecciones y proporcionar sugerencias para solucionar problemas con el fin de mejorar la tasa de éxito de las inyecciones.

Protocol

Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra que se describen en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Notre Dame. 1. Preparación de soluciones Hacer una solución 50x social de los medios de embriones E3 mezclando 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2, y 9,95 g MgSO4 en 5 litros de agua destilada, y se almacena a temperatura ambiente. Para el cultivo de los embriones de pez ce…

Representative Results

Una estación de microinyección configurar incluye un estereomicroscopio, micromanipulador y regulador de presión (Figura 1A). La transiluminación de la placa de inyección es preferible para ver las muestras durante este procedimiento (Figura 1B). Preparación de la aguja de inyección consiste en tirar el vidrio de borosilicato apropiado, seguido de la preparación del borde con el corte y finalmente de vuelta a cargar la aguja. De manera óptima, l…

Discussion

Un número diverso de agentes terapéuticos se han asociado con AKI ^29. Ha habido avances en la investigación significativo en la comprensión el daño inducido por muchos compuestos individuales, tales como la gentamicina aminoglucósido ³⁰ y el cisplatino quimioterapéutico ampliamente utilizado ^31,32. Algunos cambios patológicos implicados en estas condiciones, sin embargo, siguen siendo objeto de estudio en curso. Uno de los retos emergentes sigue siendo la comprensión de cómo m?…

Materials

Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60mm x 15mm	VWR	25373-085
100mm x 15mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150mm x 15mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24