Summary
이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.
Abstract
이 프로토콜은 조직의 항상성을 유지하는 중요한 세포 간 과정 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 (SL-DT) 기술에 대해 설명합니다. 등 독성 물질, 독소, 약물에 의한 갭 접합부 간 통신 (GJIC)의 중단은 많은 부작용 건강에 미치는 영향에 연결되어 있습니다. 많은 유전자 기반 인간 질병 갭 정션 유전자의 돌연변이에 관련되어있다. SL-DT 방식은 셀의 커다란 집단에서 GJIC의 동시 평가를위한 간단한 분석 기능이다. 분석 간략 세포 집단을 메스 블레이드 세포막을 교란하여 형광 염료와 프리로드 셀을 포함한다. 형광 염료는 그 후 지정된 시간에 대해 인접 셀에 간극 결합 채널을 통해 통과시킨다. 분석 후, 세포에 포르말린을 첨가하여 종료한다. FLUO의 확산세포의 인구를 통해 rescent 염료는 표면 형광 현미경으로 평가되고 이미지가 공개 도메인에서 발견 무료 소프트웨어 패키지를 포함하여 사용할 수있는 형태 계측 학적 소프트웨어 패키지의 수와 분석된다. 이 분석은 또한 처리 된 동물의 다양한 기관에서 조직 조각을 사용하여 생체 내 연구에 적용되고있다. 전반적으로, SL-DT 분석은 시험 관내 약리학 및 독성 요구의 넓은 범위를 제공 할 수 있으며, 잠재적으로 더 짧은 시간에 더 많은 샘플을 명료하게 자동 형광 현미경 영상 분석 높은 처리량 설정 시스템에 적용될 수있다.
Introduction
이 방법의 전체 목표는 화합물의 잠재적 인 독성을 평가하기 위해, 간단하고 비교적 저렴 광범위한 기술을 제공하는 것이다. 이것은 여러 세포주에서 사용할 수있는 시험 관내 접근법이다. 표면 형광 현미경을 갖춘 표준 세포 생물학 연구소는이 분석을 사용하여 연구를 수행 할 수 있습니다.
세포 기능의 우리의 기본 지식은 시험 관내 생물 검정에 크게 의존하고 있으며, 제약, 환경 오염 물질, 식품 태어난 오염 물질의 독성 평가에 필수적인 요소가되고있다. 불행히도, 모든 독성 종합적 평가에 대한 요구를 충족시킬 수있는 단일 관내 생물학적 검정 시스템이 없다. 시험 관내 분석의 많은 설계 및 평가뿐만 아니라 특정의 생화학 적 또는 분자 포인트를 평가하도록 최적화되어있다. 이들은 매우 자주의 섭동을 반영하도록 설정 높은 처리량 결합에스트로겐 수용체 1 신호와 같은 특정 신호 전달 경로. 이 전략은 매우 성공적 이었지만, 유전자의 발현에 관여하는 신호 전달 경로의 수는 광범위한 매우 복잡 평가하는 특정 신호 전달 경로를 선택하는 작업을한다. 높은 처리율 프로토콜은 현재 개발되고 동시에 단일 분석의 한계 중 일부를 극복하기위한 하나의 접근법을왔다 수많은 신호 전달 경로를 측정하기 위해 사용되고있다. 그러나 모든 신호 전달 경로가 성공적으로보다 포괄적 인 접근 방식에 통합되었습니다 더불어 새로운 신호 전달 경로는 지속적으로 더 복잡하게하는이 평가 과정을 발견되고있다. 특히 높은 관통 넣어 시스템, 생체 외 접근법의 광범위한 번호를 사용하여, 포괄적 인 독성 평가도 매우 고가이며 대부분의 한 조사에 도움이되지 않습니다에 대한 연구 프로젝트를 주도했다.
GJIC는 프로세스이다 TIGhtly 멤브레인 및 세포 골격 단백질과 2,3- 주요 세포 내 신호 전달 경로와 상호 작용에 의해 조정 된 전압의 변화에, 칼슘 농도의 pH, 산화 환원의 균형에 의해 제어. 따라서 GJIC의 억제는 다양한 세포 유형의 스트레스, 다른 세포의 기능 장애 또는 다른 신호 전달 경로의 섭동을 반영 할 수있다. 제한된 신호 전달 생물 검정의 이용을 극복하는 또 다른 방법은, 가장 많이있는 경우, 신호 전달 경로는 상기 간극 결합 채널 4-8 통해 협력 세포 내 신호 전달 체계에 의해 다양한 변조되는 생물학적 현상을 활용하는 것이다. 세포 내 신호 전달 체계는 다수의 다중 경로 제어하에 있더라도, 갭 정션 채널을 통해 세포 간 신호 전달은 궁극적으로 부분적으로 또는 완전히 닫힌 개폐되는 채널의 함수이다. 이것은 쉽게 다양한 사용하여 측정 할 수있는 포인트를 제공한다체외 생물 검정 시스템 7인치 조직의 항상성 세트 포인트는 갭 접합부 간 통신에 대한 화합물의 효과를 결정하는 단계, 개방 채널을 필요로 고려 (GJIC)의 화합물 4,8- 잠재적 독성을 결정하는보다 포괄적 인 접근이다. 본질적으로, 유전자 발현을 제어하는 복수의 신호 전달 사건을 조정에서 중심 역할이 중요한 생물학적 현상 독성 효과의 광범위한 평가를 허용한다. 따라서, 생물 검정 GJIC 평가는 화합물의 독성 잠재 성을 평가하는 좋은 출발점이다.
GJIC을 평가하는 데 가장 광범위한 기술이 형광 프로브로 세포를 미리로드 한 후, 인접 셀에로드 된 세포 또는 세포로부터 염색제의 이행을 감시에 기초한다. 염료를 미리로드하는 기술은 프로브 (11)의로드 (10), 및 메틸 에스테르를 긁어, 미세 주입 구를 포함했다 (10)에 의해 개발 된 전송 분석을 염색. 오히려 더 침습적 스크랩보다,이 보고서의 메스를로드하는 방법은 침략 피해를 최소화 세포 (그림 1)의 단층을 통해 라운드 블레이드와 메스의 부드러운 롤을 포함한다. 이 기술의 장점은 셀보다는 마이크로 인젝션 분석의 단일 세포 집단의 독성 평가한다. 마이크로 인젝션 기술 및 형광 프로브의 메틸 에스테르를 사용하는 기술을 사용하는 방법은 훨씬 많은 시간을 소비하며 상당히 높은 기술 수준을 요구하는 반면 또,이 분석의 단순성 단시간에 다수의 판의 빠른 검출을 허용한다.
GJIC 연구의 모든 필요를 충족하는 단일 방법이 없지만; SL-DT 분석은 할 수있는 단순하고 매우 저렴하고 다양한 분석입니다다양한 화합물의 독성의 초기 평가에 대한 요구의 대부분을 충족. 주요 장점은 다음과 같습니다 : 단순, (FRAP) 분석 및 분자 형광 프로브 분석, 대형의 GJIC의 신속하고 동시 평가 지역의 활성화를 photobleaching에 후 같은 미세 주입, 형광 복구와 같은 다른 방법에 필요한 장비 나 기술에 대한 특별한 필요 생체 내 연구를위한 자동화 된 형광 현미경 영상 분석뿐만 아니라 적응성 높은 처리량 설정에 도움이되는 세포의 수.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구의 프로토콜은 쥐가 인도적과 고통의 경감을위한 관련하여 처리 한 것을 보장하기 위해 동물 관리 및 생체은 실험이 수행 된 곳이다 일본의 건강 과학, 국립 연구소의 이용위원회에 의해 승인되었다.
1. SL-DT 생물 검정
- 이글스 함유 시드 3 × 105 WB-F344 쥐 간 상피 세포 (35) 상 mm 직경의 배양 플레이트를 37 ºC 100 % 상대 습도 (RH), 5 % 인큐베이터 배지 플러스 5 % 소 태아 혈청, 및 배양 세포를 변형 CO 2.
- 배양 세포들은 100 % 합류 (일반적으로 2 일)에 도달하고 후술하는 바와 같이 셀의 원하는 치료 실험을 수행 할 때까지.
- 복용량 응답 실험을 실시
- 10 ㎕의 100 % 아세토 니트릴 4 μL 6 μL에서 페난 트렌의 2 mM의 스톡 용액 20 μL 및 phenan의 20 mM 스톡 용액 8 μl를 추가원액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 트렌.
- 4 μL 6 μL 8 μL, 10 μL, 상기 차량 제어 역할을하는 아세토 니트릴 용액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 아세토 니트릴 100 % 용액 20 μL를 추가한다.
- 37 ° C, 100 % RH 5 % CO 2로 설정 인큐베이터에서 15 분 동안 접시를 품어.
- 1.3 단계로 진행합니다.
- 행동 시간 응답 실험
- 각 시점 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 분)에 대한 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다.
- 각 시점은 차량 제어 역할을하는 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다.
- 각 지정된 시간 페이지에 대 한 번호판을 품어37 ° C에서 항온 OINT, 100 % RH, 5 % CO 2.
- 1.3 단계로 진행합니다.
- 시간 복구 실험을 실시
- 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다.
- 차량 제어 역할을 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다.
- 페난 트렌 또는 아세토 니트릴 중 하나를 함유하는 배지를 경사 분리하고 인산염 완충 식염수 3 ㎖ (PBS)로 3 배 각 린스.
- 원하는 복구 시간 (즉, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 분) 37 ℃의 배양기에서 100 각 플레이트에 신선한 성장 배지 2 ㎖를 첨가하고 부화 % RH 및 5 % CO 2.
- 1.3 단계로 진행합니다.
- 행동의 메커니즘 실험
- 신호 전달 억제제의 추가 예
- 차량 제어 역할을 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴의 5 μL를 추가한다.
- 추가로 15 분 동안 성장 배지 플러스 D609 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다.
- 차량 제어 역할을 추가로 15 분 동안 성장 배지 플러스 100 % 아세토 니트릴 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다.
- 1.3 단계로 진행합니다.
- 복용량 응답 실험을 실시
- 어느 부드럽게 매체를 주입하여 진공 흡인에 의해 배양 배지를 버리고.
참고 : 적절하게 유해 폐기물을 포함하는 배지를 폐기 할 것. - 3 PBS ㎖의 betwee 캔트 또는 흡인 중 하나와 세포에게 3 회 씻어여기서 n은 린스.
- 피펫 1 mg을 ml의 / 루시퍼 노란색 염료는 각 셀 플레이트에 PBS (LY)에 용해 ㎖로.
- 부드럽게 판의 세 가지 영역에서 세포 집단을 둥근 모서리와 # 20 외과 스틸 칼날 압연하여 세포에 염료를 미리로드.
- 메스 수직 (90 ° 각도) 배양 접시의 가장자리에서 5mm를 배치하는 것으로 시작하고 15 ° (도 1 참조)의 각도에 대해 수직이 각도에서 메스 롤.
참고 :이 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 메스를 곤란에 의해 달성된다. (둥근 블레이드는 단순히 세포를 통해 롤백) 메스 부드럽게 15 ° 위치로 90 °에서 갈 수 있도록 중력을 사용합니다. 이 운동은 시각적으로 눈에 띄는 들여 쓰기 라인을 떠날 것이다.
- 메스 수직 (90 ° 각도) 배양 접시의 가장자리에서 5mm를 배치하는 것으로 시작하고 15 ° (도 1 참조)의 각도에 대해 수직이 각도에서 메스 롤.
- 실온에서 3 분 동안 LY 용액으로 세포를 인큐베이션.
- 경사 분리 또는 LY 대기음 모든 extrace을 제거하기 3 ㎖ PBS로 3 회 씻어llular 세포 외 배경 형광을 제거하기 위해 염색.
- 세포를 해결하기 위해 10 % 인산염 완충 포르말린 용액의 0.5 ML을 추가합니다.
참고 : 포르말린에 고정 후, 공기는 세포 건조하고 LY 염료의 최소 광표백으로 최대 2 년 동안 어둠 속에서 저장합니다. 필요한 경우, 형광 색소의 전면을 시각화하고, 10 % 포르말린 용액으로 재수. - 200X의 배율 536분의 428 나노 미터의 여기 / 방출 피크 이색 큐브를 구비 한 표면 형광 현미경을 이용하여 세포를 고정보기. 들여 쓰기 라인이 비전의 수평 필드에 평행이되도록 모든 판을 맞 춥니 다.
참고 : FITC의 이색 큐브가 잘 작동합니다.- CCD 카메라 및 지원 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다.
- CCD 카메라에 대한 지원 소프트웨어를 열고 자동 노출 설정을 사용합니다. 디지털 이미지를 획득하기 위해 "캡처"버튼을 사용합니다. "저장"버튼을 사용하여 .tif 파일로 이미지를 저장합니다.
간 조직에 SL-DT 분석 2. 적응
- 5 주 이전, 남성 피셔 344 쥐 사용하여 해부 가위에서 약 간의 왼쪽 엽에서 2 × 2cm 슬라이스를 제거하고 접시에 젖은 거즈 (12)으로 덮여 중량 측정을 플라스틱에 놓습니다.
- 피펫 0.5 내지 1 ㎎을 함유하는 PBS 용액 ㎖ / ml의 루시퍼 옐로우 및 로다 덱스 트란 (RD) 플라스틱의 간 조각의 표면에 무게 플레이트의 각.
주 : RD는 간극 결합 채널을 통과 할 수없고로드 된 셀을 표시하는 염료이다. - 날카로운 블레이드와 무게 판의 염료 용액을 가지고 간 조각의 표면에 약 1cm 길이 3 ~ 5 절개를 확인하고 절개를 채우기에 충분 추가 염료를 추가합니다.
- 접시의 무게를 플라스틱에 실온에서 3 분 동안 조직을 인큐베이션.
- PBS 5 ㎖로 3 회 헹군다.
- 조직 비켜 수정실온에서 어두운 곳에서 50 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 10 % 인산염 완충 포르말린 30 ㎖에 rnight.
- 다음 날, 물 조각을 씻어 1 × 1 × 0.5 cm 3 스트립에 가위를 해부와 절개 주위 조직을 손질 한 후 파라핀 13 조각을 포함하는 표준 기술을 사용합니다.
- 제 전까지 어둠이 5㎛의 두께로 절개 라인에 수직 인 슬라이스 저장 샘플을 마이크로톰 절편 13 표준 기술을 이용하여 묘화한다.
- 섹션 1.10 7 항에 형광 염료 전선의 이미지를 시각화하고 캡처하는 CCD 디지털 카메라가 장착 된 표면 형광 현미경을 사용합니다.
3. 정량화 GJIC
- (예 ImageJ에)은 형태 학적 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 염료 확산을 측정한다.
- "파일"탭을 클릭 한 다음 클릭을 열고 "열기"저장된 이미지.
- 염료 전면의 윤곽을 추적하기 위해 도구 모음 탭에서 "무료 손 도구"를 클릭합니다.
- 은 "분석"탭을 클릭 한 다음 "측정"을 클릭합니다.
참고 :이 원하는 경우 다른 스프레드 시트 프로그램으로 복사 할 수 있습니다 스프레드 시트의 영역 값을 생성합니다.
- 스프레드 시트 프로그램을 사용하여, 염료가하기 식을 사용하여 제어 플레이트의 이동 영역에 의한 실험 접시 염료 확산 영역을 분할하여 제어 (FOC)의 비율을 계산한다 :
E = 그러한 특정 투여 량 및 시간에서 화학 물질로 처리 된 세포와 같은 실험 변수에 노출 된 세포에서의 염료 확산 영역
관심있는 화학 물질을 용해하는 데 사용되는 비히클로 처리 된 세포는 상기 제어의 염료 확산의 C = 영역
주의 : 차량의 영향을 결정하기 위해,E는 비히클 처리 된 세포에 염료 확산 영역 것 및 C는 차량에 의해 처리되지 세포 염료 확산 영역 일 것이다. 차량의 효과는 바람직하게는 10 % 미만이어야한다.
- CCD 카메라 및 지원 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GJIC의 중단 광범위하게 불리한 건강에 미치는 영향 (14)을 유도하는 유전자 조절의 nongenotoxic, 후생 유전 학적 수준에서 독성 화합물을 식별하기위한 바이오 마커로 사용되어왔다. 예를 들어, 다환 방향족 탄화수소 (PAHs의)는 환경의 유비쿼터스 오염 물질은하지만 그들의 분자 구조 (15)의 함수로서 자신의 후생 유전 학적 독성에 따라 다릅니다. 저 분자량의 PAHs는 일반적으로 담배 연기 15,16의 오염 된 하천 퇴적물 많은 다양한 환경에서 고 분자량 PAHs에 비해 상대적으로 높은 농도로 발견된다. 페난 트렌은 베이 지역이라는 각 포켓 세 개의 벤젠 고리를 갖는다 저분자 PAH의 일례이다. 도 2는 페난 트렌의 용량 증가 처리 WB-F344 쥐 간 상피 세포 SL-DT의 일련의 이미지이다. 이주 오의 감소를 참고증가 용량과 형광 염료, 루시퍼 노란색, F. 스캔 된 이미지의 영역은 제어 (FOC)의 일부로서 결정될 수있다. 도 2의 제어는 세포 PAH 즉 아세토 니트릴에 용해시키고있는 용매로 처리된다. 일반적으로 SL-DT 실험이 실험에서 투여 될 각 실험 매개 변수에 대한 3 개의 독립적 인 시험의 최소, 각 시험에 대한 중복 또는 세중의에서 수행된다. FOC 값은 통계적 분석을 평균하고 (도 3 참조)를 그래프 화 될 수있다.
유사한 실험은 통상적으로 독성 유발 GJIC의 억제 및 세포 독성없이 매체에 전사 된 후에 GJIC의 독성이 유발 억제를 회복하기 위해 필요한 시간주기의 시간을 설정하기 위해 수행된다. 도 4는 페난 트렌에 의한 억제의 시간 응답과 복구 (모두 도시프). SL-DT 분석은 어떤 독성 독소에 의해 GJIC 4,16를 dysregulate 기전을 결정하는데 사용될 수있다. 이것은 GJIC을 dysregulates 독성 물질 또는 독소의 첨가 전에 선택된 신호 경로의 제약 억제제로 미리 배양 세포에 의해 수행된다. 독성 물질 또는 독소가 더 이상 독성이 GJIC을 dysregulate 계속하면 이러한 경로가 배제 될 수있는 반면, 시그널링 경로는,이 경로는 GJIC의 규제 통로 것으로 결정 블록 선택된 약제의 존재 GJIC을 dysregulates없는 경우. 도 5는 주체을 설명하는 일 메틸 안트라센 (1-MEA) 아니지만 포스파티딜콜린 특정 포스 포 리파제 C (PC-PLC)의 상당히 특이 억제제 인 D609의 존재하에, GJIC을 저해 다른 세 고리의 PAH. 따라서, PC-PLC는 GJIC의 1 MEA에 의한 억제에 관여 후보 신호 효소로 통치되고있다. PC-PLC의 역할은 F로 검증되었습니다urther 실험 4,16. 전반적으로, SL-DT 분석법은 독소 및 독소 (dysregulate) GJIC 억제 방법의 메카니즘에 관여 매핑 시그널링 네트워크의 프로세스를 시작하는 것은 매우 도움이된다. 이 접근법은 또한 GJIC을 dysregulating로부터 독성 물질 또는 독소를 차단할 수 천연물 스크리닝하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 레스베라트롤를 들어, 산화 방지제는 GJIC (그림 6) 억제에서 1 MEA를 방지 할 수 레드 와인과 땅콩 제품에 높은 농도로 발견했다.
SL-DT의 분석은 특히 간 (17), 동물 조직 조각에 적응하고있다. 퍼플 루오로 술폰산 (PFOA)은 간암 12,17을 유도하는 것으로 알려진 영구 환경 오염 물질 인 8 불소화 탄소 지방산이다. SL-DT 방식은 사용 PFOA 관내 WB-F344rat 간 모델 시스템 (18)에 GJIC을 억제하는 것으로 하였다. 생체 내 추적 관찰 연구 DETPFOA는 따라서 체외 모델 시스템 12,17 검증, PFOA로 치료 F344 쥐의 간에서 GJIC을 억제하는 것이 ermined. 도 7은 차량과 PFOA 처리 한 쥐의 간 조직에서의 염료 확산을 나타내는이 후속 실험에서 형광 이미지들이다.
그림 1 : 메스 염료 로딩 단계의 만화 이미지. 메스의로드 프로세스가 세포 손상을 최소화하기로 수평 세포를 통해 슬라이스보다는 블레이드 롤링 포함 보여주는 그림.
그림 2 : 염료의 대표 형광 현미경 이미지는 갭 접합을 통해 확산. WB-F344 쥐 간 상피 세포에서 함께 15 분 동안 처리 하였다페난 트렌의 용량을 주름, 널리 보급 된 PAH는 환경에서 발견했다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 페난 트렌 처리 WB-F344 쥐 간 상피 세포의 투여 량 반응 곡선. SL-DT 이미지 영역은 계산 한 다음, 차량 (아세토 니트릴)로 처리 하였다 셀 제어의 비율로보고되었다. 각 데이터 포인트는 3 개의 독립적 인 실험의 평균이고, 오차 막대는 15 분의 노출 시간 후에 각각의 투여 량에 대한 95 % 신뢰 한계의 표준 편차이다. 네 파라미터 로지스틱 함수는 데이터 요소를 통해서 배선에 맞추어 사용 하였다. cli를하시기 바랍니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 (CK).
그림 4 : 페난 트렌 처리 WB-F344 쥐 간 상피 세포의 시간과 시간 복구 응답 곡선. 노출 10 분 후 GJIC 완전히 억제 후, 배지를 포함하는 페난 트렌 페닐알라닌 (Phe)이 프 프리 중간 투입 한 후, 세포는 억제 회복을 모니터 하였다. SL-DT 이미지 영역은 계산 한 다음, 차량 (아세토 니트릴)로 처리 하였다 셀 제어의 비율로보고되었다. 각 데이터 포인트는 3 개의 독립적 인 실험의 평균이고, 오차 막대는 95 % 신뢰 한계의 표준 편차이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
her.within 페이지 = "1"> 
그림 5 : GJIC의 억제 1- 메틸 안트라센로는 포스파티딜콜린 특정 포스 포 리파제 C. 1- 메틸 안트라센 (1-MEA)에 의존하는 환경에서 발견되는 유행 PAH이다. 왼쪽 패널은 차량으로 처리 된 세포 대표 (아세토 니트릴, 0.35 %의 v / v)로. 중간 패널은 70 μM 1-MEA와 함께 15 분 동안 처리 WB-F344 쥐 간 상피 세포를 나타냅니다. 오른쪽 패널은 추가로 15 분 동안 70 μM 1 MEA을 첨가하여 50 μM의 D609, 포스파티딜콜린 특정 포스 포 리파아제 C 억제제와 함께 20 분 동안 전처리 제 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
281fig6.jpg "/>
그림 6 : 베라 트롤은 1 메틸 안트라센에 의해 GJIC의 억제를 방지. 왼쪽 패널은 차량으로 처리 된 세포 대표 (아세토 니트릴, 0.35 %의 v / v)로. 레스베라트롤은 레드 와인과 땅콩 제품에서 발견되는 항산화 제이다. 중간 패널은 70 μM 1-MEA와 함께 15 분 동안 처리 된 세포를 나타냅니다. 오른쪽 패널은 제 추가로 15 분 동안 70 μM 1 MEA 첨가 한 후 50 μM 레스베라트롤로 20 분 동안 전처리 된 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 남성 F-344 쥐에서 간 조각에서 GJIC의 전 생체 SL-DT 분석. 왼쪽 패널은 간, 담배 마는 조각을 나타냅니다24 시간 동안 차량 제어, 디메틸 설폭 사이드로 처리 된 래트에서, UE. 오른쪽 패널은 100 mg을 복강 내 투여 후 쥐에서 간 조직의 조각을 나타냅니다 / 24 시간 후 퍼플 루오로 옥 산 (PFOA)을 kg이다. PFOA, 널리 보급 된 환경 오염 물질, 간 비대를 유도하고, 체외 모델을 사용하여 갭 접합을 차단하는 시연 종양 촉진 퍼 옥시 좀 증식이다. 절개로드 염료 후, 고정 트림 및 절단 된 차량과 PFOA 처리 된 동물에서 간 조각에 이루어졌다. 환경 보건 전망 (12)로부터 재현. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SL-DT 분석은 GJIC을 측정하는 간단하고 다양한 기술이지만, 적절한 실험 프로토콜을 설계 할 때 고려되어야한다 몇 가지 중요한 문제들이있다. SL-DT 분석을 사용하여 GJIC의 강력한 측정을 위해 셀 갭 접합을 통해 LY의 좋은 염료 확산이 있어야합니다. 최소한, 적절한 시간 염료 양방향 메스로드 셀에서 셀의 8 개 이상의 행을 퍼지는 것을 보장하도록 선택되어야한다. 또한, 염료 메스로드 셀에서 이전의 거리 측정의 용이성, 제어 플레이트의 염료 확산 시야의 70 내지 90 %를 채우고 보장 배율 인자를 선택한다. WB-F344 쥐 간 상피 세포, 색소 앞에 네 개의 셀 열 넘어갈 대한 LY 용액 세 분 인큐베이션 충분하며, 200 배의 배율이 최적이다. 세포 loadi 아주 수정할 수있는 인 35mm 직경 플레이트상에서 성장메스와 세포에 염료를 ng를. 그러나, 셀은 작은 웰에서 배양 될 수 있지만, 메스의 사용은 특히 96 웰 배양 플레이트에서 불가능하다. 작은 우물의 경우, 우물에 맞게 다시, 롤링 액션을 사용할 수있는 작은 라운드로 만들어진 최첨단을 사용합니다. 이 최소 침습적이고 찢어진 원래 스크래핑 방법의 전형적인 대 세포가없는 틈을 만드는 것을 세포를 방지로드의 매우 깨끗한 라인을 제공하기 때문에이 롤링 동작은 중요한 단계입니다. 대안 적으로, 침술 니들은 니들의 작은 비틀림의 세포 내로 로딩 염료 좋은 작업을 수행하는 데 사용된다.
다른 세포 유형이이 분석법에 사용될 수있다. 그러나, 특정 세포 유형의 셀 선택 및 GJIC의 역할을 이해하는데 적절한 가설과 실험의 설계 골조 중요하다. 제 가장 확실한 단계는 세포 배양 조건되는 기능성 간극 연접은 EXPRES가 개발하는SED. 특정 대사 기능을 수행 잘 분화 된 세포 유형에 간극 연접은 일반적 인접 셀 사이의 대사 경로를 조정하는 역할을한다. 어떤, 증식 능력과 채널은 아마 자주 형태와 세포의 특정 배열에 따라 조직의 특정 대사 역할을하면 잘 분화 된 세포 유형이 제한됩니다. 예를 들어, 심장 근세포는 간극 연접은 주로 따라서 그루브 접시에서 수행 될 수있는 세포를 정렬하는 것이 필요 SL-DT 방식을 사용하여 인터 디스크에 정렬되고 연장 된 셀이다. 따라서,주의 사항은 각 셀 유형해야합니다. 신경 세포 배양과 연구는 일반적으로 컨 플루 언트되지 않으며 또한 사용되어야 SL-DT 부적절한 대안 GJIC 분석법을 사용하게되는 특정 접점을 필요로한다.
이러한 줄기 초기 전구 세포 증식 성 세포 유형에서 GJIC가 더 중요한 역할을코디에 세포 분열 사건을 조절하는 유전자의 발현을 제어하는 이벤트를 시그널링. 이 프로토콜에 사용되는 WB-F344 쥐 간 상피 세포가이 범주에 빠진다. 갭 접합 유전자는 조직 개발 및 유지 보수 19 ~ 21 동안 중요하다. 간극 결합 채널을 표현하는 모든 세포 세포막 표면 상에 형성되지만, 세포 증식을 억제하는 GJIC 성장 인자에 매우 민감하다. 증식 성 세포 유형의 긴급 고려 사항은 일반적으로 미디어의 조성물에 더 배향된다. 성장 인자, 특히 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 정의 과잉 자주, 그리고 세포의 간극 연접는 폐쇄 상태에있다. 이 세포에 GJIC을 설정하는 가장 쉬운 방법은 24 시간 그들이 apoptose 것처럼없이 혈청과 세포 너무 긴 것 있지만, 감소 또는 실험을하기 전에 4 시간 24의 혈중 농도를 제거하는 것입니다. 실험에 사용 된 WB-F344 간 상피 세포는 t로 표시그의 논문은 혈청 수준을 감소 할 필요없이 혈청 지나치게 문자를 구분하지 않습니다. 대조적으로, C10 마우스 세포주를 이용한 실험 GJIC 22 확립 빼앗긴 제 혈청이어야한다. 혈청 수준이 두 종류의 세포 사이에 차이가 있지만, 흥미롭게도, C-10 세포는 안트라센 22, 23의 메틸 이성질체 매우 유사하게 반응했다.
품질의 결과에 대한 다른 고려 사항은 비 세포 독성 용량에서 실험을 포함한다. 세포는 치료 전후 세포 형인 것으로 건강 형태 적 특징을 결정하는 위상차 현미경으로 검사 할 필요가있다. 갭 정션 기능에 대한 화합물의 효과는 일반적으로 세포 독성 반응에 의한없는 것을 보장하기 위해, 각 화합물의 세포 독성 분석을 동시에 수행되어야하고, SL-DT 분석에서 사용 된 복용량. GJIC의 화합물의 억제 효과는 가역적인지를 결정하기 위해 실험을 실시하면, 적어도 두 가지 이유에 대해 좋은 실험이다. 모가역적 시험 성 화합물 GJIC을 억제하지만 GJIC 전혀 회수가 없다면, 세포 독성 인자 및 상기 테스트가 요구 될 수 있습니다. GJIC 후 용량을 복원 및 시험 시간이었던 경우, 아마도 세포 독성이 없다. GJIC의 가역적 억제를위한 생물학적 의미가 있습니다. 많은 부담, 환경 및 식품 독성 물질과 독소의 건강에 부정적인 영향은 가역 과정이다. 따라서 분자 수준에서이 가역성을 이해하는 것이 중요합니다. 미지의 화합물을 가역적 GJIC을 저해하지 않는 경우, 생물체의 건강에 대한 영향은 대부분의 다른 제제는 상당히 다를 수 있으며 리스크 계산의 일부가 될 필요가 있었다.
GJIC의 억제와 관련된 투여 량 및 시간을 결정하는 반복적 인 프로세스이다. 문화 용품에 대한 시간과 비용을 절약하기 위해 가장 좋은 방법은 대부분의 억제로, 용해도 및 시간 (일반적으로 1 시간에 따라 높은 용량에서 시작하는 것입니다) 미만에서 15 분에 발생하고, 효과가 없어 질 때까지 다음 공정 현명한 공정에서 반 시간 및 용량을 감소시킨다. 한시간 고용량에서 더 억제가없는 경우, 단계 현명한 처리에서 시간을 두배. 초기 실험은 단일 플레이트에서 수행 될 수있다. 일반 시간 추정과 용량이 확립되면, 다음, 더 철저한 연구가 효율적으로 통계 분석에 적합한 샘플 크기로 설계 할 수있다. 하나의 실험 설계 특징 75 100 % 억제에 도달 용량과 시간을 사용하는 것이다. 물론, 결과의 최종 해석은 상기 파라미터의 요인이 될 것이다. 그러나, 첫 번째 투여 량의 시간 및 생체 내에서 관련없는 경우에도, 생물학적 효과를 결정함으로써, 설정된 용량 직업적 노출 상황에서 역할을 할 수 있고, 또는 다른 인자에 노출 일반인에게도 잠재적 인 첨가제 GJIC 영향을 미치는 또는 상승 효과.
G의 억제대부분의 화합물에 의한 JIC는 일반적으로 매우 가변되지 않고, 두 개 (각 복제에 잘 배양 접시이거나 것) 복제 세 선량 시간 반응 곡선을 생성하기에 충분하다. 가변성이 높은 경우, 다음 추가 복제는 하나의 독립적 인 시험의 주어진 종속 변수에 대한 정확한 값을 얻기 위해 필요하다. 물론, 적어도 3 개의 독립적 인 실험은 통계 분석을 위해 수행 할 필요가있다.
이 분석 상당한 세포 인구 크기의 평가의 단순성은 많은 응용 프로그램의 장점이다. 이것은 많은 독성 평가에 유용하다. 그러나 여러 가지 요인에 의존 할 수있는 SL-DT 분석의 한계가있다. 하나는 세포가 연구되고에이 기술이 적절한 지 여부입니다. 이 분석은 문화 판 또는도에 걸쳐 산발적 연락처와 높은 포화 상태에 도달하지 않은 세포에서 잘 작동하지 않을 것입니다. 이러한 미세 주입과 같은 대체 기술은 협력해야한다nsidered. 대안 적으로, SL-DT 분석은 수정 될 수있다. 로드 단일 세포에서의 성공은 염료 (7)를로드 할 때 약간의 비틀림 작용을 필요로하는 침술 바늘 달성하고있다. 염료의 확산은 산발적 세포 연락처와 세포 배양을 통해 더 합류 상황에서 반경 또는 비정질 것입니다. LY 염료 솔루션 로다 민 덱스 트란 (RD, 1 ㎎ / ㎖)의 첨가는로드 셀을 식별하는 것은 (예 : RD)를 마커없이 어려울 것이다 실험을 권장합니다. RD 따라서 세포가로드 된 식별 간극 결합 채널을 통과하기에 너무 크다. RD는 모든 SL-DT 분석에서 사용될 수 있지만, 메스 셀이로드 된 위치를 파악 접시의 바닥에 함몰을 남긴다. SL-DT 분석은 세포 유형을 구별하지 않을 염료로드 셀 등의 다른 유형 사이에서 GJIC의 변화 측정에 도움이 아니다. 또 마이크로 인젝션의 선택의 방법이지만 침 바늘 방법이다 MIG하나는 현미경을 사용하여 특정 세포를 대상으로 할 경우에도 작동 HT.
대사 협력의 분석은 GJIC을 측정하는 또 다른 방법이다. 이 방법은 GJIC 24 제 표준화 생물 검정법 중 하나였다. 이 분석에서, 야생형 중국어 햄스터 V79 세포 (6- 티오 구아닌 구분) 및 6 티오 구아닌 내성 세포는 6 티오 구아닌 (6-TG) 내성 세포를 6-TG 대사 있지 않은 높은 밀도에서 공동 배양 독성 대사 물질에 따라서 저항을 부여. 세포 사멸을 초래 간극 연접 통해 독성 대사 산물의 전달에서 6 TG 감수성 세포 결과와 공동 배양 여기서 독성 6 TG 대사 산물의 전달을 방지하여 6-TG 내성 세포의 구조에서 GJIC 결과 저해 6-TG 민감한 세포. 이 분석의 장점은 최소 침습이라고하지만, 주요 단점은 toxi 광범위한 투여 량 및 시간 의존적 평가하게 완료 대해 일주일이 필요하다는 것이다등 cants뿐만 아니라 역학적 연구, 많은 화학 물질을 평가하기위한 실용적이지.
SL-DT 분석은 미세 주사가 선호하는 방법입니다있는 다른 세포 유형을 통해 염료의 이동을 추적 할 필요가 기계론의 연구에 도움이되지 않습니다. 대안 적으로, 세포는 형광 염료의 메틸 에스테르 사전로드 될 수있다. 염료 로딩 따라서 세포에서 색소 트래핑 그 이상의 형태로 친수성 친 유성 염료를 세포 내 가수 분해 메틸 에스 테라 제의 기능이다. 이 형광 프로브를 미리로드 할 수있는 덜 침습적 방법이 있지만, 모든 세포가이 방법으로 사전로드되어 세포 간 통신을 측정하는 가장 일반적인 방법은 FRAP 분석 (11)이다. FRAP의 장점은 다시 기전 연구를위한 우수 하나의 세포에서 갭 접합을 평가 할 수있는 기능입니다. 그러나 FRAP의 단점에있다 : 독성 평가를위한 세포의 인구를 측정 할 수없는,복잡하고 비싼 현미경 / 레이저 세포 계측기에 대한 필요성, 고도로 숙련 된 기술 전문가에 대한 필요성은, 적당히 상기 레이저에 의해 생성 된 자유 라디칼의 침습, 높은 처리량에 도움이 아니다.
보다 최근에는 다른 기술이 개발되었다; 갇힌 쿠마린 형 형광체의 새로운 세대에 기초 형광 프로브 분자 (LAMP) (25)에있어서의 로컬 활성화. FRAP 분석과 유사하게, 모든 셀이 염료는 메틸 에스테르를 포함하는 사전로드되는, 그러나, 이들 염료는 아마도 FRAP보다 상당히 낮은 ROS를 생성하는 자외선의 작은 용량을 가진 레이저에 의해 후속 국부 조명시 형광된다. 다시 말하지만,이 분석은 FRAP 분석 같은 제한 사항이 있습니다. GJIC을 측정하기위한 다른 최근의 진보는 또한 메틸 에스테르 형광 염료의 사용을 포함 프리 로딩과 낙하산 기술이다. 프리 로딩 기법 현탁 포함세포를 언로드 대응 형광 프로브와 함께 미리로드 한 후 도금하여 융합 단층을 형성 할 수있다. 염료의 확산 후 표면 형광 현미경 (26)을 관찰 할 수있다. 낙하산 분석에서, 상기 형광 프로브에 프리로드 셀 언로드 세포 단층 상에 중첩되고, 염료의 확산은 표면 형광 현미경 (27)이 관찰된다. 또, 상기 기술은 높은 스루풋을 분석하고, 바로 근처에 합류 도금되어야하며, 셀의 재 부착을위한 시간 지연을 필요로 기술적으로 더 많은 도전이다.
전반적으로, SL-DT 분석은 일반적으로 대부분의 세포 배양 실험실에서 발견 CO 2 세포 배양 인큐베이터 바이오 캐비닛의 표면 형광 현미경과 같은 장비를 사용하여 비교적 저렴하고 간단한 다목적 기술이다. 최소한의 경험을 바탕으로 많은 판은 F 도움이되는 일에 처리 할 수 있습니다또는 독성뿐만 아니라 예방하거나 독성 물질과 독소의 효과를 반전 천연 제품에 대한 화합물을 스크리닝. 또한, 높은 처리량에 대한 상기 분석을 채택하는 독소 및 독소 다수 선별 할 가능성이있을 것이다 자동화 형광 현미경 영상 분석 시스템, 로봇을 이용하여 분석한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
