גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינת מודד תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער. תקשורת בין תאית גאפ junctional היא תהליך הסלולר עיקרי שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות מתוחזק שיבוש איתות התא הזה יש השפעות בריאותיות שליליות.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינה (SL-DT) טכניקת מודדת תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער, אורכת בין תאית עיקרית שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות נשמר. הפרעה של תקשורת בין תאית junctional הפער (GJIC) על ידי toxicants, רעלים, תרופות, וכו 'נקשר לנזקים בריאותיים רבים. מחל אנושיות גנטיות מבוסס רבות נקשרו מוטציות בגני צומת פער. טכניקת SL-DT היא assay שימושי פשוט עבור ההערכה סימולטני של GJIC ב אוכלוסייה גדולה של תאים. את assay כרוך תאים טרום העמסה עם צבע פלואורסצנטי ידי perturbing בקצרה קרום התא באמצעות להב סקלפל דרך אוכלוסייה של תאים. צבע פלואורסצנטי מותר אז לעבור דרך ערוצי צומת פער עם תאי שכנים במשך זמן מיועד. Assay הוא הסתיים אז על ידי תוספת של פורמלין אל התאים. ההתפשטות של fluoלצבוע rescent דרך אוכלוסייה של תאים נבחן עם מיקרוסקופ epifluorescence ואת התמונות מנותחות עם כל מספר של חבילות תוכנת morphometric זמינות, כוללים חבילות תוכנה חופשיות למצוא באתר הרשות הרבה. Assay זה גם הותאם ללימודי in vivo באמצעות בחתכי רקמה מאיברים שונים מחיות מטופלים. בסך הכל, assay SL-DT יכול לשרת מגוון רחב של במבחנה לצרכימים תרופתיים טוקסיקולוגית, והוא יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי למערכות הגדרת קצב העברת נתונים גבוהות עם הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי להבהיר יותר דגימות בתוך זמן קצר יותר.
Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק טכניקה פשוטה, מקיפה וזולה יחסית להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של תרכובות. זוהי גישה במבחנה כי ניתן להשתמש שורות תאים מרובות. מעבדות ביולוגיה של התא תקן מצויד מיקרוסקופים epifluorescence יכול לערוך מחקר באמצעות assay.
הידע הבסיסי שלנו של תא פונקציות כבר תלוי מאוד bioassays במבחנה, הפך מרכיב חיוני בהערכות טוקסיקולוגית של תרופות, מזהמים סביבתיים, ומזהמים נולדים מזון. למרבה הצער, אין מערכת מבדק אחת במבחנה שיכולה לעמוד בדרישות מקיפות עבור כל ההערכות טוקסיקולוגית. רבי מבחני חוץ גופיית מתוכננים מותאמים להעריך וכן להעריך נקודות קצה ביוכימיים או מולקולריים ייחודית. אלה די קרובות משולבים תפוקה גבוהה להגדיר לשקף הפרעות שלמסלול הולכת אותות מסוימים, כגון קולטן אסטרוגן איתות 1. אסטרטגיה זו כבר די מוצלחת, אבל מספר הרב של מסלולי העברת אותות מעורבים ביטוי גנים הופך את המשימה של בחירת מסלול איתות ספציפית להעריך מורכב למדי. פרוטוקולים גבוהים דרך-לשים כיום מפותחים והשתמשו למדוד בו זמנית מסלולים רבים איתות, אשר כבר גישה כלשהו כדי להתגבר על כמה מן המגבלות של מבחני יחיד. עם זאת, לא כל מסלולי איתות שולבו בהצלחת גישות מקיפות יותר, פלוס מסלולי איתות חדשים מתגלים כל זמן זה מסבך עוד יותר תהליך הערכה זו. שימוש במספרים נרחבים של גישות במבחנה, גבוהה במיוחד דרך-לשים מערכות עבור ערכות טוקסיקולוגית מקיפות הם גם מאוד יקרות והם לא תורמים ביותר חוקר יחיד הוביל פרויקטים מחקריים.
GJIC הוא תהליך tightly בשליטת משינוי מתח, ריכוז סידן, pH, איזון חיזור, מוסדר על ידי מסלולים ואינטראקציות הולכת אותות תאיים גדולים עם חלבונים בממברנה ואת שלד התא 2,3. לכן, עיכוב של GJIC יכול לשקף סוגים שונים של מתח הסלולר, שיבוש תפקודים תאיים שונים, או הפרעות של מסלולי העברת אותות שונים. גישה נוספת כדי להתגבר על שימוש bioassays הולכת אות המוגבלות היא לנצל את התופעות הביולוגיות כי רבים, אם לא ביותר, מסלולי העברת אותות הם מווסתים עוד יותר על ידי מערכות איתות אינטר שיתופיות בערוצי צומת פער 4-8. בעוד שמערכות איתות אינטר תוכלנה למצוא שפע ותחת שליטת מסלול מרובה, האיתות אינטר בערוצי צומת פער היא בסופו של דבר פונקציה של הערוצים להיות פתח, סגורה חלקי או סגורה לחלוטין. זה מספק נקודת קצה שניתן למדוד בקלות באמצעות שוניםבמערכות מבדק במבחנה 7. בהתחשב בכך נקודת הסט ההומיאוסטטית של רקמות דורשת ערוצים פתוחים, קביעת השפעת התרכובות על תקשורת בין תאית junctional הפער (GJIC) הוא גישה כוללת יותר בקביעת השפעות רעילות פוטנציאליות של תרכובות 4,8. בעיקרו של דבר, תופעה ביולוגית קריטית זה שמשחק תפקיד מרכזי תיאום אירועים הולכים אותות מרובים שליטת ביטוי גנים מאפשרת הערכה רחבה של השפעות רעילות. לפיכך, bioassays כי להעריך GJIC מהווה נקודת התחלה מצוינת להעריך את הפוטנציאל הרעיל של תרכובות.
הטכניקות הנרחבות ביותר בשימוש על מנת להעריך GJIC מבוססות על preloading תאים עם בדיקת ניאון ולאחר מכן ניטור הנדידה לצבוע מהתא או התאים הטעונים לתאים סמוכים. טכניקות לטעון מראש לצבוע כללו microinjection 9, לגרד טעינת 10, ו מתיל אסטרים של חלליות 11 </sup>. האיזמל העברת צבען פלורסנט הטעינה (SL-DT) השיטה היא שינוי של עומס לגרד – לצבוע assay העברת שפותחה על ידי El Fouly 10. במקום השריטה פולשני יותר, השיטה טעינת אזמל דוח זה כרוך גליל עדין של אזמל עם להב עגול דרך בשכבה של תאים למזער נזק פולשנית (איור 1). היתרונות של שיטה זו הם הערכה טוקסיקולוגית של אוכלוסייה של תאים ולא תאים בודדים של assay microinjection. יתר על כן, את הפשטות של assay זה מאפשר זיהוי מהיר של הצלחות מרובות תוך זמן קצר ואילו שיטות שימוש בטכניקות microinjection וטכניקות המשתמשות אסטרים מתיל של בדיקות ניאון באופן משמעותי יותר זמן רב ודורשים משמעותי ברמת מיומנות גבוהה יותר.
למרות שאין שיטה אחת כדי לענות על כל הצרכים של לומדי GJIC; את assay SL-DT הוא assay פשוט, זול למדי תכליתי שיכוללפגוש רב של צרכי הערכות ראשוניות של רעילות של תרכובות שונות. יתרונות עיקריים כוללים: פשטות, אין צורך מיוחד עבור ציוד או מיומנויות שנדרשים שיטות אחרות כגון microinjection, שחזור פלורסנט לאחר photobleaching (FRAP) assay והפעלה מקומית של מבחני בדיקת ניאון מולקולריים, הערכה מהירה סימולטני של GJIC ב גדול מספר התאים, תורמת הגדרת קצב העברת נתונים גבוהות עם הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי, כמו גם ההסתגלות שלה ללימודי in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
את assay SL-DT הוא טכניקה פשוטה תכליתית במדידת GJIC, אבל יש כמה חששות קריטיים כי יש היוו בעיצוב פרוטוקולי ניסוי מתאימים. עבור מדידות חזקות של GJIC באמצעות assay SL-DT שחייבת להיות התפשטות צבע טובה של LY דרך צומת פער של התאים. לכל הפחות, זמן נאות יש לבחור כדי להבטיח כי הצבע מתפשט דרך שמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C., Travis, C. C. . Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. , 165-179 (1989).
- Trosko, J. E., Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. . Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. , 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H., Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. , 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. r. o. s. k. o., Dittmar, T., Zaenkar, K. . Stem Cells and Cancer. , 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
