Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoffübertragung (SL-DT) Technik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanälen misst, das ein wichtiger interzellulären Prozess, durch den Gewebshomöostase gehalten wird. Unterbrechung der interzellulären Gap Junction – Kommunikation (GJIC) durch Noxen, Toxine, Drogen usw. zu zahlreichen negativen Auswirkungen auf die Gesundheit in Verbindung gebracht worden. Viele genetisch-bedingte Krankheiten wurden Mutationen in Gap Junction-Genen verbunden. Die SL-DT-Technik ist eine einfache Funktionstest für die simultane Beurteilung der GJIC in einer großen Population von Zellen. Der Assay beinhaltet Vorbelastung Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff kurz mit einer Skalpellklinge durch eine Population von Zellen, die Zellmembran gestört. Der Fluoreszenzfarbstoff wird dann für eine bestimmte Zeit zu benachbarten Zellen zu durchqueren, durch gap junction Kanäle erlaubt. Der Assay wird dann durch Zugabe von Formalin zu den Zellen beendet. Die Ausbreitung der Fluorescent Farbstoff durch eine Population von Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop beurteilt und die Bilder werden mit einer beliebigen Anzahl von morphologisch Softwarepakete analysiert, die verfügbar sind, einschließlich Pakete freie Software auf dem öffentlichen Bereich gefunden. Dieser Test wurde auch für in vivo – Studien unter Verwendung von Gewebeschnitten aus verschiedenen Organen von behandelten Tieren angepasst. Insgesamt kann der SL-DT – Test eine breite Palette von in – vitro – pharmakologischen und toxikologischen Bedürfnisse dienen, und kann möglicherweise für einen hohen Durchsatz Set-up – Systeme mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung und Analyse angepasst werden , um mehr Proben in kürzerer Zeit aufzuklären.
Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache, umfassende und relativ kostengünstige Technik bereitzustellen, die potentiellen Toxizitäten von Verbindungen zu bewerten. Dies ist ein in vitro – Ansatz , die in mehreren Zelllinien verwendet werden kann. Standard-Zellbiologie Labors ausgestattet mit Epifluoreszenz Mikroskope können die Forschung mit diesen Test durchführen.
Unsere Grundkenntnisse in der Zellfunktionen hat sich auf in – vitro – Biotests stark abhängig gewesen und hat eine wesentliche Komponente in die toxikologische Bewertung von Arzneimitteln, Umweltschadstoffe und Essen geboren Verunreinigungen werden. Leider gibt es keine einzige in – vitro – Bioassay – System , das die Anforderungen für alle toxikologische Bewertungen umfassend erfüllen können. Viele in vitro – Assays sind entwickelt und optimiert sowie zu bewerten als eine spezifische biochemische oder molekulare Endpunkt bewerten. Diese sind ziemlich oft kombiniert in einem hohen Durchsatz eingerichtet, um eine Störung eines reflektierenbestimmten Signaltransduktionsweg, wie Östrogen-Rezeptor – 1 signalisiert. Diese Strategie ist recht erfolgreich, aber die umfangreiche Anzahl von Signaltransduktionswegen in Genexpression beteiligt macht die Aufgabe, einen spezifischen Signalweg des Wählens recht komplex zu beurteilen. Hochdurchsatz-Protokolle werden derzeit entwickelt und verwendet, um gleichzeitig zahlreiche Signalwege messen, die ein Ansatz gewesen einige der Beschränkungen der einzelnen Tests zu überwinden. Allerdings sind nicht alle Signalwege wurden erfolgreich in umfassendere Ansätze integriert, sowie neue Signalwege ständig entdeckt werden, dass weitere verkompliziert diesen Bewertungsprozess. Mit umfangreichen Anzahl von in – vitro – Ansätzen, besonders hohe Durchsatzsysteme für umfassende toxikologische Bewertungen sind auch sehr teuer und sind nicht förderlich für die meisten Einzel Ermittler führte Forschungsprojekte.
GJIC ist ein Prozess, WIG-htly gesteuert durch Veränderungen in der Spannung, Calciumkonzentration, pH – Wert, Redox – Gleichgewicht, 2,3 von bedeutenden intrazelluläre Signalübertragungswege und Interaktionen mit Membran und Zytoskelett Proteine reguliert. Somit Hemmung der GJIC können verschiedene Arten von zellulärem Stress, Störung von verschiedenen zellulären Funktionen reflektieren oder Störungen verschiedener Signaltransduktionswege. Ein weiterer Ansatz , um die Nutzung der begrenzten Signaltransduktion Biotests zu überwinden , ist die Vorteile der biologischen Phänomene zu nehmen , dass viele, wenn nicht die meisten, Signaltransduktionswege werden durch kooperative Systeme interzelluläre Signalübertragung moduliert durch gap junction Kanäle 4-8. Obwohl interzellulären Signalsystemen auch zahlreich sind und unter mehreren Stoffwechselweg Steuerung, ist die interzelluläre Signalübertragung durch Gap Junction Kanäle letztlich eine Funktion der Kanäle geöffnet wird, teilweise geschlossene oder ganz geschlossen. Dies stellt einen Endpunkt, der leicht gemessen werden kann unter Verwendung verschiedenerIn – vitro – Bioassay – Systeme 7. Bedenkt man, dass die Homöostase Sollwert eines Gewebes offene Kanäle erfordert, um die Wirkung der Verbindungen auf die interzelluläre Kommunikation über Gap junctions Bestimmung (GJIC) ist ein umfassender Ansatz in 4,8 potentiellen toxischen Wirkungen von Verbindungen zu bestimmen. Im Wesentlichen diese kritische biologische Phänomen, das eine zentrale Rolle spielt mehrere Signaltransduktionsereignissen bei der Koordinierung der Expression Steuerung Gen ermöglicht eine umfassende Bewertung der toxischen Wirkungen. So Biotests, die GJIC sind ein ausgezeichneter Ausgangspunkt beurteilen das toxische Potenzial von Verbindungen zu bewerten.
Die umfangreichsten verwendeten Techniken GJIC zur Beurteilung basieren auf Zellen mit einer fluoreszierenden Sonde und dann die Überwachung der Migration des Farbstoffs aus der beladenen Zelle oder Zellen zu benachbarten Zellen Vorbelastung. Techniken , um den Farbstoff vorzubelasten haben beteiligten Mikroinjektions 9, Scrape Loading 10, und Methylester der Sonden 11 </sup>. Das Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoffübertragung (SL-DT) Verfahren ist eine Modifikation der schaben Last – FARBSTOFF Assay Transfer entwickelt von El Fouly 10. Anstatt die mehr invasive schaben, das Skalpell Ladeverfahren dieses Berichts beinhaltet eine sanfte Rolle eines Skalpells mit einer runden Klinge durch eine Monoschicht von Zellen , die invasive Schaden (Abbildung 1) zu minimieren. Die Vorteile dieser Technik sind die toxikologische Beurteilung einer Population von Zellen, anstatt einzelne Zellen des Mikroinjektionsassay. Darüber hinaus ermöglicht die Einfachheit dieses Tests für die schnelle Detektion von mehreren Platten in kurzer Zeit während Methoden Mikroinjektionstechniken und Techniken, die Methylester von Fluoreszenzsonden verwenden wesentlich zeitaufwendig und erfordern eine wesentlich höhere Fähigkeitsniveau.
Zwar gibt es keine einzige Methode, die Bedürfnisse aller GJIC des Studiums zu erfüllen; SL-DT-Test ist eine einfache, relativ kostengünstig und vielseitig Test, der kannviele der Anforderungen für die erste Bewertung der Toxizitäten verschiedener Verbindungen erfüllen. Hauptvorteile sind: Einfachheit, keine besondere Notwendigkeit für die Ausrüstung oder Fähigkeiten, die für andere Verfahren, wie Mikroinjektion, fluoreszierende Erholung nach Photobleaching (FRAP) -Assay und lokale Aktivierung von molekularem fluoreszierenden Sonden-Assays, eine schnelle und gleichzeitiger Beurteilung von GJIC in einem großen erforderlichen Anzahl der Zellen, förderlich für eine hohe Durchsatzaufbau mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie – Bildgebung und Analyse sowie seine Anpassungsfähigkeit für in vivo – Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der SL-DT-Test ist eine einfache und vielseitige Technik in GJIC messen, aber es gibt mehrere kritische Bedenken, die berücksichtigt werden sollten geeignete experimentelle Protokolle in der Gestaltung. Für robuste Messungen von GJIC die SL-DT-Test dort verwendet, muss eine gute Farbstoff Ausbreitung des LY durch gap junctions der Zellen sein. Zumindest sollte eine ausreichende Zeit, um sicherzustellen, gewählt werden, dass der Farbstoff breitet sich durch acht oder mehrere Reihen von Zellen aus den Skalpell beladene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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