间隙连接通讯：天然产物的生物标志物的功能，以评估毒物和毒素的不利影响，以及健康的益处
Summary
本协议描述，通过间隙连接通道测量细胞间通讯手术刀装载荧光染料转移技术。间隙连接通讯是一个主要的细胞过程，其中组织稳态维持这种细胞信号中断了不良的健康影响。
Abstract
这个协议描述，其测量通过间隙连接通道间通讯，这是一个主要间过程，其中组织稳态保持手术刀放入荧光染料转移（SL-DT）技术。由毒物，毒素，药物等间隙连接通讯（GJIC）的中断已被链接到大量的不良健康影响。许多基于遗传人类疾病都与在间隙连接的基因突变。在SL-DT技术是GJIC在一个人口众多细胞的同时评估一个简单的功能测定。该测定通过细胞群体简要扰动细胞膜用手术刀刀片涉及预加载的细胞用荧光染料。然后荧光染料允许间隙连接通道横穿通过对相邻小区一段指定的时间。该试验然后通过加入福尔马林至细胞终止。在萤光灯的传播通过细胞群体rescent染料评估用落射荧光显微镜和图像被任何数量的形态软件包可用，包括在公共领域发现自由软件包进行分析。此法也适用于使用组织切片从处理过的动物各器官的体内研究。总体而言，对SL-DT测定可以起到广泛的体外药理学和毒理学的需要，并且可以潜在地适于使用自动荧光显微镜成像和分析的高通量设置系统在较短的时间以阐明更多的样品。
Introduction
该方法的总的目标是提供一种简单的，全面和相对廉价的技术来评估化合物的潜在毒性。这是一种体外方法，可以在多种细胞系中使用。配备有落射荧光显微镜标准细胞生物学实验室可以通过此法进行研究。
我们的细胞功能的基本知识已经高度依赖于在体外生物测定，并已成为医药品，环境污染物，以及食品生污染物的毒理学评估的必要成分。不幸的是，没有一个统一的体外生物测定系统，能够全面地满足所有毒理学评估的要求。许多体外测定的设计和优化，以评估以及评估一个特定的生物化学或分子端点。这些经常以高通量设置以反映一个扰动组合特定信号转导途径，如雌激素受体信号1。这一策略相当成功，但参与基因表达的信号转导通路的数量繁多，因此选择一个特定的信号通路，以评估相当复杂的任务。高通量的协议，目前正在开发的，并用于同时测量许多信号传导途径，这一直是一个方法克服一些单个分析的局限性。然而，并非所有的信号通路已经成功掺入更全面的办法，再加上新的信号传导途径正在不断地被发现，进一步复杂化这个评估过程。使用的体外方法广泛数字，特别是高通量系统中，综合毒理学评估也非常昂贵，并且不利于大多数单研究者领导的研究项目。
GJIC是一个过程TIG通过在电压变化，钙离子浓度，pH值，氧化还原平衡，由主要的细胞内信号转导途径和相互作用与膜和细胞骨架蛋白2,3-调节htly控制。因此，GJIC的抑制可以反映不同类型的细胞应激，不同的细胞功能的破坏，或不同的信号转导途径的扰动。克服利用有限的信号转导的生物测定的另一种方法是采取的生物现象优点，即许多，如果不是大多数，信号转导途径被进一步通过合作的细胞间的信号系统，通过间隙连接通道4-8调制。虽然间信号系统也很多，根据多路径控制，通过间隙连接通道间信号是最终被打开的通道的功能，部分封闭或完全封闭。这提供了可以使用各种可容易地测定的端点在体外生物分析系统7。考虑到组织的稳态设定点，需要畅通的渠道，确定化合物对间隙连接通讯的影响（GJIC）在确定化合物4,8的潜在的毒性作用更全面的方法。在本质上，在协调多个信号转导事件控制基因表达的核心作用这一关键的生物现象，使得毒性作用广泛评估。因此，评估GJIC生物测定是一个很好的起点，以评估化合物的潜在毒性。
用于评估GJIC最广泛的技术是基于预加载的细胞用荧光探针，然后从所装载的细胞或细胞相邻小区监控染料的迁移。技术预加载染料都涉及显微注射9，刮去探头11装载10和甲基酯</suP>。手术刀装载荧光染料转移（SL-DT）的方法是刮负载的修改-染料埃尔Fouly 10开发的传输试验。而不是更微创刮，本报告的手术刀加载方法包括通过细胞减少侵入破坏（ 图1）单层圆刀片手术刀的温柔卷。这种技术的优点是细胞而非显微注射法的单细胞的群体的毒理学评估。此外，该测定的简单性允许在短时间内快速检测多块板而使用显微注射技术以及使用荧光探针的甲酯技术方法都是显著更费时，并且需要相当高的技术水平。
虽然没有单一的方法来满足研究细胞间隙连接通讯的所有需求;在SL-DT分析是一种简单的，相当便宜，多才多艺的分析，可以满足多种需求的各种化合物毒性的初步评估。主要优点包括：简单，设备或技能没有特殊需要所需要的其他方法，如微注射，荧光漂白恢复（FRAP）分析和分子荧光探针测定法，GJIC的在一个大一个快速和同时评估的局部激活后细胞的数目，有利于高通量设置用自动化荧光显微镜成像和分析，以及其适应性对于体内研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
对SL-DT测定是在测定GJIC简单和通用的技术，但也有要在设计适当的实验方案来解释几个关键的关注。对于使用SL-DT测定细胞间隙连接通讯的强大的测量必须有通过细胞间隙连接的LY良好的染料扩散。在最低限度，有足够的时间应选择以保证染料通过八个或更多列细胞扩展从两个方向的手术刀加载细胞。另外，为了便于将染料从手术刀装载的细胞迁移的距离的测量，选择确保了控制板的染料扩散填充…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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