Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

Summary

Este protocolo descreve uma técnica de transferência de bisturi de carga e corante fluorescente que mede comunicação intercelular através dos canais de junções de hiato. Gap comunicação intercelular juncional é um importante processo celular pelo qual a homeostase do tecido é mantido e ruptura dessa sinalização celular tem efeitos adversos para a saúde.

Abstract

Este protocolo descreve uma técnica (SL-DT) bisturi carregamento-corante fluorescente transferência que mede a comunicação intercelular através de canais de junções de hiato, que é um importante processo intercelular através da qual a homeostase do tecido é mantida. A interrupção da comunicação intercelular por junções de hiato (CIJH) por agentes tóxicos, toxinas, fármacos, etc. tem sido associada a numerosos efeitos prejudiciais à saúde. Muitas doenças humanas genéticas à base de ter sido associada a mutações nos genes de junções de hiato. A técnica de SL-DT é um ensaio funcional simples para a avaliação simultânea de CIJH em uma grande população de células. O ensaio envolve as células de pré-carregamento com um corante fluorescente através da perturbação da membrana celular brevemente com uma lâmina de bisturi através de uma população de células. O corante fluorescente é então deixada a atravessar através de canais de junções de hiato às células vizinhas por um tempo designado. O ensaio é então terminada através da adição de formalina para as células. A propagação do fluodye rescent através de uma população de células é avaliada com um microscópio de epifluorescência e as imagens são analisadas com qualquer número de pacotes de software morfométricas que estão disponíveis, incluindo pacotes de software livres encontrados no domínio público. Este ensaio também foi adaptado para estudos in vivo utilizando fatias de tecido de vários órgãos de animais tratados. No geral, o ensaio de SL-DT pode servir uma ampla gama de necessidades farmacológicos e toxicológicos in vitro, e pode ser potencialmente adaptado para sistemas set-up alto rendimento com imagens de microscopia de fluorescência automatizada e análise para elucidar mais amostras em menos tempo.

Introduction

O objectivo geral do presente método é o de proporcionar uma técnica simples, relativamente barato e abrangente para avaliar a toxicidade potencial dos compostos. Esta é uma abordagem in vitro que pode ser usado em várias linhas celulares. laboratórios de biologia celular standard equipados com microscópios de epifluorescência pode conduzir pesquisas com este ensaio.

Nosso conhecimento básico de funções celulares tem sido altamente dependente de bioensaios in vitro, e tornou-se um componente essencial nas avaliações toxicológicas de produtos farmacêuticos, poluentes ambientais e alimentares nascido contaminantes. Infelizmente, não existe um único sistema in vitro bioensaio que podem exaustivamente atender às demandas de todas as avaliações toxicológicas. Muitos ensaios in vitro foram concebidas e optimizadas para avaliar, assim como um ponto de extremidade avaliar bioquímica ou molecular específico. Estes são muitas vezes combinados em uma alta taxa de transferência configurado de modo a reflectir uma perturbação de umdeterminada via de transdução de sinal, tais como estrogénio-receptor de sinalização ^1. Esta estratégia tem sido bastante bem sucedido, mas o número grande de vias de transdução de sinais envolvidos na expressão do gene torna a tarefa de escolha de uma via de sinalização específicas para avaliar bastante complexa. Elevadas protocolos através colocam-estão actualmente a ser desenvolvidos e utilizados para medir simultaneamente numerosas vias de sinalização, o que tem sido uma abordagem para ultrapassar algumas das limitações dos ensaios individuais. No entanto, nem todas as vias de sinalização foram incorporados com sucesso em abordagens mais abrangentes, além de novas vias de sinalização estão constantemente a ser descoberto que torna ainda mais complicado esse processo de avaliação. Utilizando números extensos de abordagens in vitro, particularmente elevada por meio-put sistemas, para avaliações toxicológicas abrangentes também são muito caros e não são conducentes a maioria investigador único liderado projectos de investigação.

GJIC é um tig processohtly controlada por mudanças na tensão, concentração de cálcio, pH, equilíbrio redox, reguladas pelas principais vias de transdução de sinal intracelular e interações com proteínas da membrana e do citoesqueleto ^2,3. Assim, a inibição da CIJH pode reflectir diferentes tipos de stress celular, disrupção de funções celulares diferentes, ou perturbações de diferentes vias de transdução de sinal. Outra abordagem para superar o uso de bioensaios de transdução de sinal é limitado para tirar partido dos fenómenos biológicos que muitos, se não a maioria, vias de transdução do sinal modulado são ainda por sistemas de sinalização intercelular cooperativas através de canais de junções de hiato ^4-8. Embora os sistemas de sinalização intercelular também são numerosos e sob controlo via múltipla, a sinalização intercelular através de canais de junções de hiato é em última análise, uma função dos canais a ser aberta, parcialmente fechado ou completamente fechado. Isto proporciona um ponto de extremidade, que pode ser facilmente medida utilizando váriasem sistemas de bioensaio in vitro ^7. Considerando-se que o ponto de regulação homeostático de um tecido requer canais abertos, a determinação do efeito dos compostos sobre junções de hiato comunicação intercelular (CIJH) é uma abordagem mais abrangente na determinação de potenciais efeitos tóxicos de compostos ^4,8. Na sua essência, este fenómeno biológico crítico que desempenha um papel central na coordenação de múltiplos eventos de transdução de sinais que controlam a expressão de genes permite uma avaliação global de efeitos tóxicos. Assim, os bioensaios para avaliar a CIJH é um excelente ponto de partida para avaliar o potencial tóxico de compostos.

As técnicas mais extensas utilizados para avaliar a CIJH são baseados em pré-carregamento de células com uma sonda fluorescente e, em seguida, o controlo da migração do corante a partir da célula ou células carregado para células adjacentes. Técnicas para pré-carregar o corante ter envolvido microinjeção ^9, raspar de carga ¹⁰ e metil ésteres das sondas ¹¹ </sup>. A bisturi de carga-fluorescente de transferência de corante (SL-DT) é uma modificação do método de carga de raspagem – tingir ensaio de transferência desenvolvida pela El Fouly ^10. Em vez de a raspagem mais invasivo, o método bisturi carregamento deste relatório envolve um rolo suave de um bisturi com uma lâmina redonda através de uma monocamada de células que minimizam os danos invasiva (figura 1). As vantagens desta técnica são a avaliação toxicológica de uma população de células, em vez de células individuais do ensaio de micro-injecção. Além disso, a simplicidade desta ensaio permite a detecção rápida de várias placas num curto período de tempo enquanto que os métodos que utilizam técnicas e técnicas que usam os ésteres metílicos de sondas fluorescentes microinjecção são significativamente mais demorado e requer consideravelmente mais elevado nível de habilidade.

Embora não haja nenhum método único para atender a todas as necessidades de estudar GJIC; o ensaio de SL-DT é um ensaio simples, relativamente barato e versátil que podesatisfazer muitas das necessidades de avaliações iniciais de toxicidade de diversos compostos. As principais vantagens incluem: simplicidade, não há necessidade especial para o equipamento ou capacidades que são necessários para outros métodos, tais como micro-injecção, recuperação de fluorescência após a fotodegradação de ensaio (FRAP) e activação de locais de ensaios com sondas fluorescentes moleculares, uma avaliação rápida e simultânea da CIJH em um grande número de células, conducente a uma alta taxa de set-up com imagens de fluorescência e análise automatizada microscopia, bem como a sua adaptabilidade para estudos in vivo.

Protocol

O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Animal Care e do Comitê Utilização dos Institutos Nacionais de Ciências da Saúde do Japão, que é onde o in vivo experimentos foram feitos, para garantir que os ratos foram tratados com humanidade e com respeito pelo alívio do sofrimento. 1. SL-DT Bioensaio Semente de 3 x 10 5 WB-F344 células epiteliais de fígado de rato Onto 35 mm placas de cultura de diâmetro contendo Eagles modificado médias mais soro bovino fetal a 5%, e cul…

Representative Results

Interrupção da GJIC tem sido amplamente utilizada como um biomarcador para identificar compostos tóxicos ao nível genotóxica, epigenética de controle do gene que induz efeitos adversos à saúde 14. Por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são contaminantes ubíquos do meio ambiente, mas variam em suas toxicidades epigenéticas em função das suas estruturas moleculares 15. Os PAHs de baixo peso molecular são normalmente encontrados em …

Discussion

O ensaio de SL-DT é uma técnica simples e versátil para medir GJIC, mas existem várias preocupações críticas que deveriam ser contabilizados na concepção de protocolos experimentais apropriados. Para medições consistentes de CIJH utilizando o ensaio de SL-DT deve haver um bom corante propagação da LY através de junções das células. No mínimo, um tempo adequado deve ser seleccionado para assegurar que a tinta se espalha através de oito ou mais linhas de células a partir de células de bisturi carregad…

Materials

WB-F344 rat liver epithelial cells	From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC)	none	Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
35 mm Culture Plates	Corning	430165
25 cm2 culture flasks	Corning	430639
75 cm2 culture flasks	Corning	430641
D-medium, an Eagles modified medium	ThermoFisher/GIBCO	Formula No. 78-5470EF
fetal bovine serum	ThermoFisher/GIBCO	10437
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher/GIBCO	15050
phosphate buffered saline	homemade	see below for ingredient cat#'s	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl	JT Baker – Mallinckrodt	3040-01
NaCl	JT Baker – Mallinckrodt	3624-05
Na2HPO4	JT Baker – Mallinckrodt	3819–01
KH2PO4	JT Baker – Mallinckrodt	3246-01
Lucifer Yellow CH, lithium salt	Sigma-Aldrich Chemical	L0259
rhodamine-dextran	Sigma-Aldrich Chemical	R9379
1-methylanthracene	Sigma-Aldrich Chemical
phenanthrene	Sigma-Aldrich Chemical	P11409
resveratrol	Sigma-Aldrich Chemical	R5010
D609	Tocris Bioscience	1437
acetonitril	EMD	AX0145-1
37% solution formaldehyde	JT Baker – Mallinckrodt	2106-01
#20 surgical blade	Fine Science Tools Inc.	10317-14
50 mL conical sterile tubes	Thermo scientific	339652
Nikon epifluorescence microscope	Nikon -Mager Scientific	Eclipse TE300
Nikon FITC dichroic cube	Nikon -Mager Scientific	96107
CCD camera	Nikon -Mager Scientific	Nikon Cool Snap EZ CCD
imaging system.	Nikon -Mager Scientific	Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system.
Image J	National Institute of Health	http://imagej.nih.gov/ij/