Summary
Denne protokollen beskriver en skalpell lasting-fluorescerende fargestoff overføringsteknikk som måler interkommunikasjon gjennom gap junction kanaler. Gap junctional inter kommunikasjon er en viktig cellulær prosess der vev homeostase er vedlikeholdt og avbrudd av denne cellesignalisering har negative helseeffekter.
Abstract
Denne protokollen beskriver en skalpell laste-fluorescerende fargestoff overføring (SL-DT) teknikk som måler intercellulær kommunikasjon gjennom gap junction kanaler, noe som er en stor interprosess ved hvilken vev homeostase opprettholdes. Avbrudd av gap junctional interkommunikasjon (GJIC) av giftstoffer, toksiner, narkotika osv har vært knyttet til en rekke negative helseeffekter. Mange genetiske baserte sykdommer hos mennesker har vært knyttet til mutasjoner i gap junction gener. SL-DT teknikk er en enkel funksjonell prøve for simultan evaluering av GJIC i en stor populasjon av celler. Analysen omfatter forbelastning av celler med et fluorescerende fargestoff ved kort å perturbere cellemembranen med et skalpellblad gjennom en populasjon av celler. Det fluorescerende fargestoff tillates deretter å traversere gjennom gap junction kanaler til naboceller for en angitt tidsperiode. Analysen ble deretter avsluttet ved tilsetning av formalin til cellene. Spredningen av fluorescent fargestoff gjennom en populasjon av celler vurderes med en epifluorescence mikroskop og bildene er analysert med en rekke morfometriske programvarepakker som er tilgjengelige, inkludert gratis programvarepakker som finnes på den offentlige sfæren. Denne analysen har også blitt tilpasset for in vivo-studier ved bruk av vevssnitt fra forskjellige organer fra behandlede dyr. Totalt sett, SL-DT analysen kan tjene et bredt spekter av in vitro farmakologiske og toksikologiske behov, og kan eventuelt tilpasses for høy gjennomstrømning set-up systemer med automatisert fluorescens mikroskopi avbildning og analyse for å belyse flere prøver i løpet av kortere tid.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å tilveiebringe en enkel, fullstendig og relativt billig teknikk for å vurdere den potensielle toksisitet av forbindelsene. Dette er en in vitro-metode som kan brukes i flere cellelinjer. Standard cellebiologi laboratorier utstyrt med epifluorescence mikroskop kan forske ved hjelp av denne analysen.
Vår grunnleggende kunnskap om cellefunksjoner har vært svært avhengig av in vitro bioassay, og har blitt en viktig komponent i toksikologiske vurderinger av legemidler, miljøgifter og nærings født forurensninger. Dessverre, det er ingen enkel in vitro bioassay system som omfattende kan møte kravene for alle toksikologiske vurderinger. Mange in vitro-undersøkelser er konstruert og optimalisert for å evaluere samt vurdere en spesifikk biokjemisk eller molekyl endepunkt. Disse er ganske ofte kombinert i en høy gjennomstrømning satt opp for å reflektere en forstyrrelse av enviss signaltransduksjonsbane, for eksempel østrogen-reseptor-signale 1. Denne strategien har vært ganske vellykket, men den omfattende antall signaloverføringsveier involvert i genuttrykk gjør oppgaven med å velge en bestemt signalveien for å vurdere ganske komplisert. Høye gjennomstrømning protokoller er under utvikling og brukes til å samtidig måle en rekke signalveier, som har vært en tilnærming for å overvinne noen av begrensningene i enkle analyser. Imidlertid har ikke alle signalveier blitt innarbeidet i mer omfattende tilnærminger, pluss nye signalveier blir stadig oppdaget at ytterligere kompliserer denne vurderingsprosessen. Ved hjelp av omfattende tall for in vitro tilnærminger, spesielt høy gjennomstrømning systemer for omfattende toksikologiske vurderingene er også svært kostbart og er ikke bidrar til mest enkelt etterforsker ledet forskningsprosjekter.
GJIC er en prosess tightly styrt av overspenninger, kalsium konsentrasjon, pH, redox balanse, regulert av store intracellulære signaloverføringsveier og interaksjoner med membran og cytoskjelett proteiner 2,3. Således kan inhibering av GJIC reflektere forskjellige typer av cellulært stress, forstyrrelser av forskjellige cellulære funksjoner, eller forstyrrelser av forskjellige signaloverføringsveier. En annen tilnærming for å overvinne den begrensede bruk av signaloverførings bioanalyser er å dra nytte av de biologiske fenomener at mange, om ikke de fleste, signaltransduksjonsveier blir ytterligere modulert med samvirkende intracellulære signaliseringssystemer gjennomgangsspalte forbindelseskanaler 4-8. Selv om det intercellulære signaleringssystemer er også tallrike og under flere sti-kontroll, er det intercellulære signaleringen gjennom gap junction kanalene til slutt en funksjon av kanalene blir åpnet, delvis lukket eller helt lukket. Dette gir et endepunkt som lett kan måles ved hjelp av ulikein vitro bioassay systemer 7. Tatt i betraktning at homeostatic sett poenget med en vev krever åpne kanaler, bestemme effekten av forbindelser på gap junctional interkommunikasjon (GJIC) er en mer helhetlig tilnærming i å bestemme mulige toksiske effekter av stoffer 4,8. I hovedsak denne kritiske biologisk fenomen som spiller en sentral rolle i koordineringen av flere signaloverførings hendelser som kontrollerer genuttrykk gir en bred vurdering av toksiske effekter. Dermed bioassay som vurderer GJIC er et utmerket utgangspunkt for å vurdere den giftige potensialet i forbindelser.
Den mest omfattende teknikker som brukes for å vurdere GJIC er basert på forhåndslaste-celler med en fluorescerende probe, og deretter overvåke overføringen av fargestoff fra den belastede cellen eller cellene i tilstøtende celler. Teknikker for å forspenningen av fargestoffet har omfattet mikroinjeksjon 9, skrape lasting 10, og metylesterne av sondene 11 10. I stedet for den mer invasive skrape, skalpell lasting fremgangsmåte av denne rapporten innebærer en svak rull med en skalpell med en rund blad gjennom et monolag av celler som minimerer invasiv skade (figur 1). Fordelene med denne teknikken er de toksikologiske vurderingen av en populasjon av celler i stedet for enkle celler av mikroinjeksjon analysen. Videre enkelheten i denne analysen gir mulighet for rask påvisning av flere plater i en kort tid mens metoder under anvendelse av mikroinjeksjon teknikker og teknikker som bruker metylestere av fluorescerende prober er betydelig mer tidkrevende og kreve betydelig høyere ferdighetsnivå.
Selv om det er ingen enkel metode for å møte alle behovene til å studere GJIC; SL-DT-analysen er en enkel, forholdsvis billig og allsidig assay som kanmøte mange av behovene for innledende vurdering av toksisitet av ulike forbindelser. De viktigste fordeler er: enkelhet, ingen spesielle behov for utstyr eller ferdigheter som er nødvendig for andre metoder som mikroinjeksjon, fluorescerende restitusjon etter fotobleking (FRAP) analyse og lokal aktivering av molekyl fluorescerende probe assays, en hurtig og samtidig vurdering av GJIC i en stor antall celler, som bidrar til en høy gjennomstrømning satt opp med automatisert fluorescens mikroskopi avbildning og analyse, så vel som dens tilpasningsevne for in vivo-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for denne studien ble godkjent av Animal Care og Utnyttelse Committee of National Institutes of Health Sciences i Japan, som er der in vivo forsøk ble gjort, for å sikre at rottene ble behandlet humant og med respekt for lindring av lidelse.
1. SL-DT Bioassay
- Seed 3 x 10 5 WB-F344 rottelever-epitelceller bort på 35 mm diameter kulturplater inneholdende Eagles modifisert medium pluss 5% føtalt bovint serum, og kultur cellene i en inkubator ved 37 ° C, 100% relativ fuktighet (RH), 5% CO 2.
- Kultur av cellene før de når 100% konfluens (vanligvis 2 dager) og utføre den ønskede eksperimentell behandling av cellene, som beskrevet nedenfor.
- Gjennomføre doserespons Experiments
- Tilsett 10 pl og 20 pl av en 2 mM forrådsoppløsning av fenantren i 100% acetonitril og 4 ul, 6 ul, og 8 ul av en 20 mM stamløsning av phenanthrene i 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium for hvert ekstra volum av stamløsningen.
- Tilsett 4 mL, 6 ul, 8 ul, 10 ul og 20 ul av en 100% oppløsning av acetonitril og tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium for hvert ekstra volum av acetonitril-løsning for å tjene som bærerkontrollen.
- Inkuber platene i 15 minutter i en inkubator innstilt på 37 ° C, 100% relativ fuktighet og 5% CO2.
- Gå videre til trinn 1.3.
- Conduct tidsrespons Experiments
- Legge til 7 ul av en 20 mM stamløsning av fenantren i 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium for hvert tidspunkt (dvs., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- Legge til 7 ul av 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium for hvert tidspunkt for å tjene som bærerkontrollen.
- Inkuber plater for hver angitte tidspunktet point i en inkubator ved 37 ° C, 100% relativ fuktighet og 5% CO2.
- Gå videre til trinn 1.3.
- Gjennomføre Tid Deknings Experiments
- Legge til 7 ul av en 20 mM stamløsning av fenantren i 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium i 15 minutter.
- Legge til 7 ul av 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium i 15 minutter for å tjene som bærerkontrollen.
- Dekanter medium inneholdende enten fenantren eller acetonitril og skyll 3x hver med 3 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett 2 ml friskt vekstmedium til hver plate og inkuberes i de ønskede utvinning ganger (dvs. 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) i en inkubator ved 37 ° C, 100 % RH og 5% CO 2.
- Gå videre til trinn 1.3.
- Conduct Mechanism Eksperimenter
- Tilsett signaltransduksjon hemmere, dvs.
- Tilsett 5 ul av 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml vekstmedium i 15 minutter for å tjene som bærerkontrollen.
- Legge til 7 ul av en 20 mM stamløsning av fenantren i 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml av vekstmedium pluss D609 i ytterligere 15 min.
- Legge til 7 ul av 100% acetonitril til tre plater av celler inneholdende 2 ml av vekstmedium pluss 100% acetonitril i ytterligere 15 min for å tjene som bærerkontrollen.
- Gå videre til trinn 1.3.
- Gjennomføre doserespons Experiments
- Kast kulturmediet enten ved å forsiktig helle av mediet eller ved vakuumsug.
Merk: Kast dyrkingsmedium som inneholder farlig avfall på riktig måte. - Skyll cellene tre ganger hver med 3 ml PBS og enten decant eller aspirer between skyller.
- Pipetter 1 ml av 1 mg / ml Lucifer gult fargestoff oppløst i PBS (LY) inn i hver celle plate.
- Preload fargestoff inn i cellene av bølgende en # 20 kirurgisk stål blad med en avrundet kant gjennom en populasjon av celler i tre ulike områder av platen.
- Begynn med å plassere den skalpell vinkelrette (90 ° vinkel) og 5 mm fra kanten av kulturplaten, og deretter rulle den skalpell fra denne vinkelrett vinkel til omtrent en vinkel på 15 ° (se figur 1).
Merk: Dette oppnås ved å knipe skalpell mellom pekefingeren og tommelen. Bruker tyngdekraften til å tillate skalpell for å forsiktig gå fra 90 ° til 15 ° stilling (som den avrundede bladet bare ruller over cellene). Denne bevegelsen vil etterlate et visuelt merkbar innrykk linje.
- Begynn med å plassere den skalpell vinkelrette (90 ° vinkel) og 5 mm fra kanten av kulturplaten, og deretter rulle den skalpell fra denne vinkelrett vinkel til omtrent en vinkel på 15 ° (se figur 1).
- Cellene inkuberes med det LY løsningen i 3 minutter ved romtemperatur.
- Dekanter eller aspirer LY og skyll tre ganger med 3 ml PBS for å fjerne all extracellular farge for å eliminere ekstracellulære bakgrunn fluorescens.
- Tilsett 0,5 ml 10% fosfatbuffret formalin løsning for å fiksere cellene.
Merk: Etter festing i formalin, luft tørke cellene og lagre i mørket i inntil to år, med minimum fotobleking av LY fargestoff. Når det er nødvendig, rehydrere med 10% formalin løsning for å visualisere det fluorescerende fargestoff foran. - Vise de fikserte celler ved hjelp av et mikroskop utstyrt med epifluorescens en dikroisk kube for eksitering / emisjonstoppene 428/536 nm ved en forstørrelse på 200X. Juster alle plater slik at innskjæringen linje er parallell med det horisontale synsfelt.
Merk: En FITC dichroic kuben fungerer godt.- Ta bildet med en CCD-kamera og støtte for programvare.
- Åpne støtteprogramvare for CCD kamera og bruke innstillingene for autoeksponering. Bruk "capture" -knappen for å digitalt hente bildet. Lagre bildet som TIF filer ved hjelp av "Lagre" -knappen.
2. Tilpasning av SL-DT-analysen til levervev
- Fjern omtrent en 2 x 2 cm stykke fra venstre flik av en lever fra en fem uker gamle, mannlige Fischer 344 rotter ved hjelp disseksjon saks og plassere den på en plast veie plate dekket med våt gasbind 12.
- Pipetter 0,5 ml av en PBS-oppløsning inneholdende 1 mg / ml hver av Lucifer gult og rhodamin-dekstran (RD) på overflaten av leveren skive i plast veie platen.
Merk: RD er et fargestoff som ikke kan krysse gap junction kanaler og vil markere celler som ble lastet. - Gjøre tre til fem innsnitt omtrent 1 cm lange på overflaten av leveren skive som har fargestoffoppløsningen i veie plate med en skarp kniv og deretter legge til ekstra fargestoff tilstrekkelig til å fylle snittene.
- Inkuber vev i 3 minutter ved romtemperatur på plast veie platen.
- Skyll tre ganger med 5 ml PBS.
- Fest vev overnight i 30 ml 10% fosfatbuffret formalin i et 50 ml konisk sentrifugerør i mørket ved romtemperatur.
- Dagen etter vask skiver med vann, trimme vevet rundt snittet med dissekere saks til 1 x 1 x 0,5 cm 3 strimler og deretter bruke standardteknikker til å legge skivene i parafin 13.
- § skivene vinkelrett på snittet linje til tykkelse på 5 mikrometer og lagre prøvene i mørket inntil klar til å bli fotografert ved hjelp av standard snitt teknikker med en mikrotom 13.
- Bruk en epifluorescence mikroskop utstyrt med en CCD digitalt kamera til å visualisere og fange bilder av de fluorescerende fargestoff fronter i henhold til § 1.10 7.
3. Kvantifisering GJIC
- Måle fluorescerende fargestoff spredning ved hjelp av et morfometrisk programvarepakke (f.eks ImageJ).
- Klikk på "File" -fanen og deretter "åpne" for å åpnelagret bilde.
- Klikk på "Free Hand Tool" på verktøylinjen Tab for å spore omrisset av fargestoff front.
- Klikk på "Analyser" -fanen og deretter "Mål".
Merk: Dette vil generere et område verdi i et regneark, som kan kopieres inn i andre regnearkprogrammer hvis ønskelig.
- Ved hjelp av et regnearkprogram, er å beregne brøkdel av kontrollen (FOC) ved å dividere arealet av fargestoff spredningen i forsøksplaten i området fargestoffet reist i styreplaten ved hjelp av følgende ligning:
A e = område av fargestoffet spredningen i celler eksponert for en eksperimentell variabel, slik som celler behandlet med en kjemisk ved en bestemt dose eller tids
A c = område av fargestoffet spredningen i kontrollen, som er celler behandlet med det kjøretøy som brukes for å oppløse den kjemiske av interesse
Merk: For å bestemme effekten av kjøretøyet,A e vil være i området av fargestoffet spredningen i celler behandlet med kjøretøyet og A C vil være i området av fargestoffet spredning i celler som ikke var behandlet med kjøretøyet. Effekten av kjøretøyet bør fortrinnsvis være mindre enn 10%.
- Ta bildet med en CCD-kamera og støtte for programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avbrudd av GJIC har vært mye brukt som en biomarkør for å identifisere giftige forbindelser ved gentoksisk, epigenetisk nivå av genet kontroll som induserer negative helseeffekter 14. For eksempel, polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) er allestedsnærværende forurensninger av miljøet, men varierer i sine epigenetiske toksisitet som en funksjon av deres molekylære strukturer 15. De lavere molekylvekt PAH finnes vanligvis ved relativt høyere konsentrasjoner enn de med høyere molekylvekt PAH i mange forskjellige miljøer som er forurenset elve sedimenter til det i sigarettrøyk 15,16. Fenantren er et eksempel på en lav molekylvekt PAH som har tre benzenringer med en vinkelformet lomme kalt bukten regionen. Figur 2 er en serie av SL-DT bilder av WB-F344 rottelever-epitel-celler behandlet med økende doser av fenantren. Legg merke til at reduksjonen i migrasjon of fluorescerende fargestoff, Lucifer Yellow, med økende doser. Områdene av de skannede bildene kan bestemmes som en brøkdel av kontroll (FOC). Kontrollen for figur 2 blir cellene behandlet med løsningsmidlet som PAH ble oppløst i, nemlig acetonitril. Typisk SL-DT eksperimenter er utført i duplikat eller triplikat for hvert forsøk med et minimum av tre uavhengige forsøk for hver forsøksparameter, noe som ville være en dose i dette eksperimentet. De FOC verdiene kan så bli midlet, statistisk analysert, og deretter fremstilles grafisk (se figur 3).
Lignende eksperimenter er også rutinemessig utført for å fastsette tiden for giftstoffet-indusert hemming av GJIC, og tidsperioden som trengs for å gjenopprette fra dette giftstoff-indusert hemming av GJIC etter at cellene blir overført til giftstoff-fritt medium. Figur 4 viser både tidsresponsen og utvinning fra inhibering av fenantren (Phe). SL-DT analysen kan også bli brukt til å bestemme underliggende mekanismer som giftstoff og giftstoffer dysregulate GJIC 4,16. Dette gjøres ved å pre-inkubere celler med en farmasøytisk inhibitor av en valgt signalveien før tilsetningen av giftstoffet eller toksin som dysregulates GJIC. Dersom giftstoffet eller toksinet ikke lenger dysregulates GJIC i nærvær av en valgt legemiddel som blokkerer en signalveien, da denne veien blir bestemt for å være et regulatorisk svei GJIC, mens slike veier kan utelukkes dersom giftstoffet fortsetter å dysregulate GJIC. Figur 5 viser dette prinsippet, hvor en-methylanthracene (1-MEA), en annen tre-ringmerket PAH som hemmer GJIC, men ikke i nærvær av D609, som er en ganske spesifikk hemmer av fosfatidylcholin spesifikk fosfolipase C (PC-PLC). Dermed er PC-PLC styrte inn som en kandidat signale enzym som er involvert i en-MEA-indusert hemming av GJIC. Rollen til PC-PLC er validert med further eksperimentering 4,16. Totalt sett er SL-DT-analyser er ganske bidrar til å begynne prosessen med å kartlegge signalnettverk involvert i mekanismene for hvordan giftstoffer og giftstoffer hemme (dysregulate) GJIC. Denne tilnærmingen kan også brukes til å screene for naturlige produkter som kan blokkere et giftstoff eller toksin fra dysregulating GJIC. For eksempel, resveratrol, en antioksidant som finnes i høye konsentrasjoner i rødvin og peanut produkter kan hindre en-MEA fra hemme GJIC (figur 6).
SL-DT-analysen er tilpasset til vevssnitt fra dyr, særlig i leveren 17. Perfluoroktansyre (PFOA) er en 8-karbon fluorerte fettsyre som er en vedvarende miljøgift kjent for å indusere leverkreft 12,17. Ved hjelp av SL-DT teknikk PFOA ble vist å hemme GJIC i en in vitro WB-F344rat leveren modellsystem 18. En in vivo oppfølgingsstudie Fondetermined at PFOA også hemmet GJIC i leveren hos F344 rotter behandlet med PFOA, således validere in vitro modellsystem 12,17. Figur 7 er fluorescerende bilder fra dette oppfølgingseksperimentet viser fargestoffet spredningen i leveren vev av rotter behandlet med bilen og PFOA.
Figur 1: Cartoon bilde av skalpell fargestoff lasting trinn. En illustrasjon som viser at skalpell lasting prosessen innebærer å rulle blad i stedet for horisontalt igjennom cellene for å minimalisere celleskade.
Figur 2: Representative fluorescerende mikroskopiske bilder av fargestoffet spredt gjennom gap veikryss. WB-F344 rottelever-epitel-celler ble behandlet i 15 min med ibretter doser av fenantren, en utbredt PAH finnes i miljøet. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dose responskurven for fenantren-behandlede WB-F344 rottelever-epitelceller. Områder av SL-DT bilder ble beregnet og deretter rapportert som en fraksjon av den kontroll som ble cellene behandlet med bærer (acetonitril). Hvert datapunkt er et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter og feilstolpene er standardavvik på 95% konfidens grense for hver dose etter en 15 minutters eksponeringstid. En fire parameters logistisk funksjon ble brukt til å passe linje gjennom datapunktene. Vennligst CLIck her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Gang på utvinning responskurve av fenantren-behandlet WB-F344 rottelever epitelceller. Etter fullstendig inhibering av GJIC etter 10 minutter med eksponering, ble medium inneholdende fenantren (Phe) byttet til Phe-fritt medium og deretter cellene ble overvåket for utvinning fra inhibering. Områder av SL-DT bilder ble beregnet og deretter rapportert som en fraksjon av den kontroll som ble cellene behandlet med bærer (acetonitril). Hvert datapunkt er et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter og feil barer er standardavvik på 95% konfidensintervall grense. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
her.within-page = "1"> 
Figur 5: Inhibering av GJIC ved 1-methylanthracene er avhengig av fosfatidylcholin spesifikk fosfolipase C. 1-methylanthracene (1-MEA) er et utbredt PAH finnes i miljøet. Det venstre panelet representerer celler behandlet med kjøretøyet (acetonitril, 0,35% v / v). Det midtre panelet representerer WB-F344 rottelever epitelceller behandlet i 15 min med 70 mikrometer 1-Mea. Høyre panel representerer celler forbehandlet først i 20 minutter med 50 uM D609, et fosfatidylcholin spesifikk fosfolipase C-inhibitor, fulgt av tilsetning av 70 uM 1-mea i ytterligere 15 min. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
281fig6.jpg "/>
Figur 6: resveratrol hindret inhiberingen av GJIC ved 1-methylanthracene. Det venstre panelet representerer celler behandlet med kjøretøyet (acetonitril, 0,35% v / v). Resveratrol er en antioksidant som finnes i rødvin og peanut produkter. Det midtre panelet representerer celler behandlet i 15 min med 70 mikrometer 1-Mea. Høyre panel viser cellene først forbehandlet i 20 minutter med 50 uM resveratrol etterfulgt av tilsetning av 70 uM 1-mea i ytterligere 15 min. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Ex vivo SL-DT analyser av GJIC i lever skiver fra mannlige F-344 rotter. Den venstre panel representerer en bit av lever tissue fra en rotte behandlet med bilen kontroll, dimetylsulfoksyd, i 24 timer. Høyre panel viser et stykke av levervev fra en rotte etter intraperitoneal administrering av 100 mg / kg perfluoroktansyre (PFOA) etter 24 timer. PFOA, en utbredt miljø forurensning, er en svulst fremme peroksisomproliferatoraktiverende som induserer hepatomegali og demonstrert for å blokkere gap veikryss ved hjelp av en in vitro modell. Snittet er lagt fargestoff ble utført på lever skiver fra kjøretøyet og PFOA behandlede dyr, som deretter ble løst, trimmet og i snitt. Gjengitt fra Environmental Health Perspectives 12. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SL-DT-analysen er en enkel og allsidig teknikk i å måle GJIC, men det er flere kritiske spørsmål som bør tas hensyn til i utformingen av hensiktsmessige eksperimentelle protokoller. For robuste målinger av GJIC bruker SL-DT-analysen må det være en god fargestoff spredning av LY gjennom gap veikryss i cellene. Som et minimum bør en tilstrekkelig tid velges for å sikre at fargestoffet spres gjennom åtte eller flere rader av celler fra skalpell lastet cellene i begge retninger. Også, for enkel måling av den avstand som fargestoff overføres fra skalpell lastet cellene, velge en forstørrelsesfaktor som sikrer fargestoffet spredningen av styreplatene fylles 70 til 90% av synsfeltet. For WB-F344 rottelever-epitelceller, tre minutters inkubasjon med den LY løsning er tilstrekkelig for fargestoffet foran til å gå utover fire cellerader, og en forstørrelse på 200X er optimal. Celler blir dyrket på plater med diameter 35 mm, noe som er ganske amendable til loading fargestoff inn i cellene med en skalpell. Imidlertid kan celler dyrkes i små brønner, men bruk av en skalpell ikke er mulig, særlig i 96-brønners kulturplater. For små brønner, bruk en liten rund tupp cutting edge som kan passe inn i brønnen, og igjen, kan du bruke en rullende handling. Denne rulle handling er et kritisk trinn som det er minimalt invasiv og gir en meget ren linje av laste som hindrer cellene i å bli revet og skaper en stor celle-fri gap som er typisk for den opprinnelige skrapende metode. Alternativt kan en akupunktur nål brukes der en liten twist av nålen gjør en fin jobb med lasting fargestoff inn i cellene.
Andre celletyper kan anvendes i denne analysen. Imidlertid er valget av celler og å forstå rollen til GJIC i en bestemt celletype viktig for utformingen av egnede hypoteser og utformingen av forsøkene. Den første og mest åpenbare steg er å utvikle celledyrkningsforholdene der funksjonelle gap veikryss er expressed. I godt differensierte celletyper, som utfører spesifikke metabolske funksjoner, gap veikryss vanligvis spiller en rolle i koordineringen av metabolske veier mellom tilstøtende celler. Godt differensierte celletyper er begrenset, om noen, proliferative kapasitet og kanalene sannsynligvis spiller en vevsspesifikk metabolsk rolle som ofte er avhengig av morfologi og spesifikke arrangement av celler. For eksempel hjertemuskelceller er langstrakte celler hvor gap veikryss er hovedsakelig innrettet på mellomlag plater, og dermed bruke SL-DT metoden ville kreve samkjøre cellene, noe som kan gjøres i en riflet parabolen. Således må nøye betraktninger gjøres for hver celletype. Studier med neuronale cellekulturer vanligvis ikke blir sammenflytende og også krever spesielle kontaktpunkter, noe som gjør bruken av SL-DT upassende og alternative GJIC analyser må brukes.
I proliferativ celletyper, for eksempel stammen og tidlige stamceller, spiller GJIC en mer kritisk rollei å koordinere celle signaliserer hendelser som styrer genuttrykk regulere mitogen hendelser. De WB-F344 rottelever epitelceller som brukes i denne protokollen faller inn under denne kategorien. Gap junction gener er kritisk under vev utvikling og vedlikehold 19-21. Selv om gap junction kanaler uttrykkes og utformet på alle celleplasmamembranflater, proliferative cellene er meget følsomme for vekstfaktorer som inhiberer GJIC. Kritiske betraktninger for proliferative celletyper er vanligvis orientert mer til sammensetningen av mediet. Vekstfaktorer ofte er i overskudd, særlig i udefinert medium inneholdende føtalt bovint serum, og cellenes gap junctions kan være i en lukket tilstand. Den enkleste måten å etablere GJIC i disse celler, er å redusere eller fjerne serumnivåene i 4 til 24 timer før utprøving, selv om 24 timer ville være for lang for celler uten serum som de ville apoptose. De WB-F344 lever epitelceller brukt for eksperimentene presentert i thans papir er ikke altfor følsomme for serum uten behov for å redusere serumnivåer. I kontrast, må eksperimenter med en C10 musecellelinje være første serum fratatt å etablere GJIC 22. Selv om serumnivåene variere mellom de to celletyper, interessant nok, C-10 celler reagerte svært likt metyl isomerer av antracen 22,23.
Andre hensyn til kvalitet resultater inkluderer gjennomføre forsøkene på ikke-cytotoksiske doser. Celler må kontrolleres med fasekontrastmikroskopi for å bestemme friske morfologiske egenskaper som forventes av den celletype før og etter behandling. For å sikre at effekten av en forbindelse på gap junction funksjon er ikke skyldes en generell cytotoksisk respons, bør cytotoksisitetsanalyser for hver forbindelse utføres på samme tid og dose som ble brukt i SL-DT-analyse. Gjennomføre eksperimenter for å bestemme om en inhiberende virkning av en forbindelse på GJIC er reversibel er også en god eksperiment for minst to grunner. Most testede forbindelser reversibelt inhiberer GJIC, men hvis det ikke er noen bedring av GJIC, da cytotoksisitet kan være en faktor, og videre testing ville være nødvendig. Men hvis GJIC gjenopprettes deretter dose og tid testet var sannsynligvis ikke cytotoksisk. Det er biologiske konsekvenser for reversibel hemming av GJIC. De negative helseeffekter av mange miljømessige og matbårne miljøgifter og toksiner er en reversibel prosess. Derfor forstå denne reversibilitet på molekylnivå er viktig. Hvis en ukjent forbindelsen ikke reversibelt hemme GJIC, da konsekvensene for helsen til en organisme kan være ganske forskjellig fra de fleste andre agenter og må være en del av risikoberegninger.
Å bestemme den dose og tid er involvert i hemming av GJIC er en iterativ prosess. For å spare tid og penger for kultur forsyninger, er den beste måten å begynne på en høy dose, som avhenger av oppløselighet og tid (vanligvis en time, som de fleste hemmingforekommer i mindre enn 15 min), og deretter redusere den tid og dosering til det halve i en trinnvis prosess inntil det ikke er noen virkning. Hvis det ikke er noen inhibering ved en høy dose i en time, deretter dobbelte av tidsperioden i en trinnvis prosess. Innledende eksperimenter kan utføres på en enkelt plate. Når de generelle tidsestimater og doser er etablert, da flere grundige undersøkelser kan effektivt utformet med passende utvalgsstørrelser for statistiske analyser. En eksperimentell design funksjon vil være å bruke den dose og tid som nå 75 til 100% inhibering. Selvfølgelig vil de endelige tolkninger av resultatet bli en faktor av de ovennevnte parametre. Imidlertid, ved først å bestemme en biologisk effekt, selv om den dose og tid ikke kan være relevant in vivo, kan de etablerte doser spille en rolle i situasjoner med yrkesmessig eksponering, eller for å generelle populasjoner eksponert for andre faktorer som også påvirker GJIC med potensiell additiv eller synergieffekter.
Inhiberingen av GJIC av de fleste forbindelser er vanligvis ikke svært variabel og to til tre gjentak (hver replikat ville være en kulturplate eller i tillegg) er tilstrekkelig til å generere doseresponskurver og tid. Men hvis variabiliteten er høy da flere gjentak ville være nødvendig for å få en nøyaktig verdi for en gitt avhengig variabel av en uavhengig studie. Selvfølgelig, minst tre uavhengige forsøk må gjøres for statistiske analyser.
Enkelheten i denne analyse og vurdering av vesentlige cellepopulasjonsstørrelse er en fordel for mange anvendelser. Dette er spesielt nyttig i mange toksikologiske vurderinger. Det er imidlertid begrensninger i SL-DT-analyser, noe som kan avhenge av flere faktorer. En er om denne teknikken er egnet for cellene som blir studert. Denne analysen vil ikke fungere godt for celler som ikke når høyt konfluens med sporadiske kontakter over hele kultur plate eller godt. Alternative teknikker, slik som mikroinjeksjon skal considered. Alternativt kan den SL-DT-analysen modifiseres. Suksess i lasteenkeltceller er oppnådd med en akupunkturnål, noe som krever en liten vridning handling ved lasting fargestoff 7. Spredningen av fargestoffet ville være radial i mer konfluente situasjoner eller amorf gjennom cellekultur med sporadiske cellekontakter. Tilsetningen av Rhodamine dekstran (RD, 1 mg / ml) til den LY fargestoffoppløsningen anbefales for forsøk hvor identifisering av de lastede celler ville være vanskelig uten en markør (for eksempel RD). RD er for stor til å krysse gap junction kanaler, og dermed identifisere hvilke celler ble lastet inn. RD kan også benyttes i alle SL-DT-analysen, men det skalpell etterlater et skår på undersiden av fatet å identifisere hvor cellene er lastet. SL-DT-analysen er heller ikke bidrar til å måle endringer i GJIC mellom ulike celletypene som fargestoff lasting vil ikke diskriminere mellom celletyper. Igjen mikroinjeksjon er metoden for valg, men akupunktur nål metode migHT også fungere hvis man kan målrette en bestemt celle ved hjelp av et mikroskop.
Den metabolske samarbeidet analysen er en annen metode for å måle GJIC. Denne metoden var en av de første standardiserte bioassay for GJIC 24. I denne analysen villtype kinesisk hamster V79-celler (6-tioguanin og små bokstaver) og 6-tioguanin-resistente celler ble ko-dyrket ved høye tettheter i hvilke 6-tioguanin (6-TG) resistente celler ikke metaboliserer 6-TG til en toksisk metabolitt, og dermed gir resistens. Ko-kultur med 6-TG-sensitive celler resulterer i overføring av toksiske metabolitter gjennom gap veikryss som resulterer i celledød hvor inhibering av GJIC resulterer i redning av 6-TG-resistente celler ved å forhindre overføring av det toksiske 6-TG metabolitt fra 6-TG-følsomme celler. Selv om en fordel ved denne analysen er at det er minimalt invasiv, er en stor ulempe at det krever en uke for gjennomføring, som gjør utstrakt dose og tidsavhengige vurderinger av toxicants samt mekanistiske studier osv upraktisk for å vurdere mange kjemikalier.
SL-DT-analysen er ikke bidrar til mekanistiske undersøkelser som trenger å spore vandring av fargestoffer gjennom ulike celletyper, hvori mikroinjeksjon er den foretrukne metode. Alternativt kan cellene bli forhåndslastet med metylesteren av fluorescerende fargestoffer. Lastingen av fargestoffet er en funksjon av intracellulære metyl- esteraser som hydrolyserer den lipofile fargestoffet i dens mer hydrofile form, således overlapping fargestoffet i cellene. Dette er en mindre invasiv måte å preload fluorescerende probe, men den mest vanlige måten å måle inter kommunikasjon der alle cellene er forhåndslastet med denne metoden er FRAP analysen 11. Fordelen med FRAP er igjen muligheten til å vurdere gap veikryss i enkeltceller, som er utmerket for mekanistiske studier. Men ulempen med FRAP ligger i: manglende evne til å måle populasjoner av celler for toksikologiske vurderinger,behovet for sofistikerte og svært dyre mikroskoper / laser cytometere, behovet for dyktige teknisk ekspertise, er moderat invasiv fra frie radikaler produsert av laser, og ikke bidrar til høy gjennomstrømming.
I den senere tid en annen teknikk som har blitt utviklet; den lokale aktivering av molekylær fluorescerende probe (LAMP) metode 25, som er basert på en ny generasjon av bur kumarinliknende fluorophores. I likhet med den FRAP-analysen, er alle cellene forhåndslastet med fargestoffer som inneholder en metylester, men disse fargestoffer som lyser opp ved påfølgende lokalisert belysning av lasere med en liten dose av ultrafiolett lys, noe som sannsynligvis produserer betydelig lavere enn ROS FRAP. Igjen har denne analysen de samme begrensningene til FRAP analysen. Andre nylige fremskritt for å måle GJIC er forbelastningen og fallskjerm teknikker, som også involverer bruk av metyl-ester-fluorescerende fargestoffer. Den preloading teknikken innebærer å suspenderecellene forhåndslastet med fluorescerende probe sammen med de losses motparter og blir deretter sådd ut og tillatt å danne et konfluent monolag. Spredningen av fargestoffet kan deretter observeres med et mikroskop epifluorescens 26. I fallskjerm analysen blir cellene forhåndslastet med den fluorescerende probe lagt over et monolag av celler losset, og spredning av fargestoffet er observert med en epifluorescens mikroskop 27. Igjen er de ovennevnte teknikker er teknisk mer utfordrende for høy gjennomstrømning analyser, og må umiddelbart belagt ved nær konfluens og krever et tidsforsinkelsen for den reattachment av celler.
Totalt sett er SL-DT-analysen en relativt billig, enkel og allsidig teknikk som bruker utstyr som for eksempel CO 2 cellekultur inkubatorer, biosikkerhet skap og epifluorescence mikroskop, som vanligvis finnes i de fleste cellekultur laboratorier. Med minimal erfaring mange plater kan behandles på en dag, noe som bidrar feller screening av forbindelser for toksisitet så vel som for naturprodukter som hindrer eller reversere effektene av miljøgifter og toksiner. Også tilpasse denne analysen for høy gjennomstrømming analyser ved hjelp av robotteknologi, med automatiserte fluorescens mikroskopi bildebehandling og analysesystemer vil ha potensial til å screene store mengder giftstoffer og giftstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
