量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
量子ドット（QD）ナノ粒子は、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究のために使用することができる方法が記載されています。ストレプトアビジンコンジュゲートさ585 nmのカドミウムセレン（CdSeの）量子ドット（QD）とビオチン化二次抗体および可視化に続いて、我々はソマトスタチンに対する一次抗体を用いて、ヒトソマトスタチン腫瘍の超薄エポキシセクションを免疫標識されているプロトコルを、実証するために。切片を次に、広視野蛍光光学顕微鏡による観察のためにスライドガラス上に載置されたTEM試料グリッド上に搭載されています。光学顕微鏡は、腫瘍細胞の細胞質内の顆粒状のパターンを形成する明るいオレンジ色の蛍光として585 nmのQDラベルを明らかにする。ミッドレンジ拡大を低で光学顕微鏡により標識パターンを容易に認識することができ、非特異的またはバックグラウンドの標識のレベルを評価しました。これは非常に重要ですその後のTEMによる免疫標識パターンの解釈及び形態学的状況の評価のためのステップ。同じセクションは、その後、乾燥ブロットし、TEMにより観察されます。 QDプローブは、個々の分泌顆粒に含まれる非晶質材料に取り付けられるように見られています。画像は、相関分析のための光学顕微鏡で見て興味（ROI）の同じ領域から取得されます。各モダリティからの画像を対応する、次に対応する領域のTEM超微細構造上の蛍光データをオーバーレイするために配合することができます。
Introduction
相関軽および電子顕微鏡（CLEM）は、過渡ダイナミックイベント1、まれな事象2、3、複雑なシステム4の分析のための強力なアプローチです。一般的な要件は、単一の試料6の同じ構造が複数の顕微鏡モダリティにより撮像されることがあるが提起された課題に応じて、5利用可能な多くの異なる技術的な順列があります。 CLEMに対する当社の特定のアプローチは、アーカイブヒト病理組織の研究と十分に特徴付けられ、7以前に公開されている、ここで使用される場合のために開発されました。目的は、超微細構造レベルで見られる免疫細胞化学標識パターンの文脈を理解しやすくするために、蛍光光学顕微鏡を使用すること、第二に、単一の生検または外科的サンプルから分析データを最大化するために、まずました。
量子ドットナノ結晶（量子ドット）は、ユニバーサルマーカーシステムABLの可能性を提供しますeは両方によって観察される、蛍光光学顕微鏡および電子顕微鏡8、9、10。それらの結晶コア構造は、それらの発光スペクトル11から遠い波長の光によって励起されると、異なるサイズの量子ドットは、蛍光発光ピークの広い範囲を生成することができます。それらの原子量は、透過型電子顕微鏡、走査型透過電子顕微鏡（STEM）や電界放射型走査電子顕微鏡によって検出可能な電子密度をもたらすのに十分です。単一量子ドットは、標的分子12ごとにQDの最終的な感度を与える観察され得るように、それらは、特に免疫細胞化学研究に適しています。さらに、QDに応じて、それらがマッピングするのに適した個々の元素シグネチャーを有することができる使用しました。
ヒト病理サンプルは、翻訳生物医学研究のための重要な利点を提供します。外科的組織生検サンプルが日常的にバイオバンクのためにとappropに提出されますriate倫理クリアランスは、調査研究のためにアクセスすることができます。ヒト組織は、動物においてまたは疾患のインビトロモデルで発生する可能性があります関連性や解釈の問題を持っていません。しかし、病理試料の試料調製は、しばしば最適ではありません。不適切な固定液は、ホルマリンではなく、TEMや不適切なサンプリングのためのグルタルアルデヒドとして使用する固定液中に配置されている組織の遅れ、がある場合もあります。 CLEM法は、単一のヒトのサンプルから利用可能な診断および予後情報を最適化する可能性を秘めています。しかし、このようなミニ一重項酸素発生器（miniSOG）を用いたものなど、いくつかの新たに開発された相関アプローチが原因で、遺伝的に興味13の細胞内に符号化されるべきタグの必要性への病理学で使用することはできません。このような理由から、我々は相関免疫細胞化学的研究のための日常準備TEM組織のQD標識の有用性を検討しています。李からエッチングされたエポキシ樹脂またはアクリル樹脂のセクションに適用される量子ドットghtlyアルデヒド固定生検および組織サンプルは、単一のサンプルから相関蛍光光学顕微鏡とTEMデータを得る可能性を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、CLEM研究のためのユニバーサルプローブとしてQDの潜在的有用性を実証してきました。使用される585 nmのQDナノ粒子は、広視野光顕微鏡で見たときに明るく安定した蛍光を示し、容易にTEMにより観察しました。本著者の一つ前の研究では、超解像光学顕微鏡7に適するように量子ドットを示しています。その光安定性、拡張視聴期間と長いイメージング・エクスポージャー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
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