Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
É descrito um método em que as nanopartículas de quantum dot (QD) pode ser utilizado para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido patologia humana usando microscopia de luz e de fluorescência de campo amplo microscopia electrónica de transmissão (TEM). Para demonstrar o protocolo temos immunolabeled epoxi secções ultrafinas de tumor Somatostatinoma humana utilizando um anticorpo primário para somatostatina, seguido por um anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina conjugada com visualização 585 nm cádmio-selênio (CdSe) quantum dots (QDs). As secções são montadas sobre uma grelha TEM espécime, em seguida, colocado sobre uma lâmina de vidro para observação ao microscópio óptico de fluorescência de campo amplo. A microscopia de luz revela rotulagem QD 585 nm como fluorescência laranja brilhante formando um padrão granular dentro do citoplasma da célula de tumor. Em baixa para ampliação de gama média por microscopia de luz do padrão de marcação pode ser facilmente reconhecido e o nível de rotulagem não-específica ou de fundo avaliada. Esta é uma críticapasso subsequente para interpretação do padrão de imunomarcação por TEM e avaliação morfológica do contexto. A mesma seção é então seco com papel absorvente e visualizado por TEM. QD sondas são vistos para ser ligado a material amorfo contidos em grânulos de secreção individuais. As imagens são adquiridas a partir da mesma região de interesse (ROI) visto por microscopia de luz para análise de correlação. Correspondendo imagens de cada modalidade pode então ser misturada para sobrepor os dados de fluorescência em MET ultraestrutura da região correspondente.
Introduction
Luz- correlativa e microscopia eletrônica (CLEM) é uma abordagem poderosa para a análise de eventos dinâmicos transitórios 1, eventos raros 2, 3 e complexos sistemas de 4. Há muitas permutações diferentes técnicas disponíveis 5, dependendo da questão que se coloca no entanto um requisito comum é que a mesma estrutura em uma única amostra 6 é fotografada por várias modalidades de microscopia. Nossa abordagem específica para CLEM foi desenvolvido para o estudo do tecido patologia humana de arquivo eo caso usada aqui foi bem caracterizada e publicado anteriormente 7. O objectivo era, em primeiro lugar, para maximizar os dados analíticos de uma única amostra de biópsia ou cirurgia e, por outro, para usar a microscopia de fluorescência de luz para ajudar a esclarecer o contexto do padrão de marcação imunocitoquímica visto ao nível ultra-estrutural.
nanocristais de pontos quânticos (QDs) oferecem o potencial de um marcador universal abl sistemaE para ser visto por tanto, a microscopia de luz de fluorescência e microscopia electrónica 8, 9, 10. A sua estrutura de núcleo cristalino permite QDs de tamanhos diferentes para gerar uma vasta gama de picos de emissão de fluorescência quando excitada pela luz em comprimentos de onda para longe dos seus espectros de emissão 11. O seu peso atômico é suficiente para produzir densidade de elétrons que é detectável por microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) ou microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo. Eles são particularmente adequados para estudos imunocitoquímicos como até mesmo QDs individuais podem ser observados dando uma sensibilidade final de um QD por molécula-alvo 12. Além disso, dependendo do QD utilizados podem possuir uma assinatura elementar indivíduo adequado para mapeamento.
amostras de patologia humana oferecem benefícios significativos para a investigação biomédica translacional. amostras de tecido cirúrgico e biópsia são rotineiramente submetidos à biobanking e com appropfolgas ética riate pode ser acessado por estudos de investigação. Tecido humano não tem questões de relevância ou de interpretação que podem ocorrer em animais ou em modelos in vitro de doença. No entanto, a preparação de amostras de amostras de patologia muitas vezes não é o ideal. Pode haver atraso no tecido a ser colocado no fixador, inadequado fixador utilizado tal como formalina, em vez de glutaraldeído por TEM e inadequado amostragem. CLEM métodos têm o potencial para optimizar a informação de diagnóstico e de prognóstico disponível a partir de uma única amostra humana. No entanto, algumas abordagens correlativos recentemente desenvolvidas, tais como as que utilizam mini-gerador de oxigénio singuleto (miniSOG) não estão disponíveis para utilização em patologia, devido à necessidade de que a etiqueta seja geneticamente codificados na célula de interesse 13. Por esta razão temos explorado a utilidade de rotulagem QD de tecido TEM rotineiramente preparados para estudos imunocitoquímicos correlativos. QDs aplicado a epoxi gravado ou secções de resina acrílica de Liamostras de biópsia e tecidos ghtly aldeído fixos oferecem a possibilidade de obtenção de microscopia de luz de fluorescência correlativa e os dados TEM partir de uma única amostra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo demonstrou a utilidade potencial de QDs como sondas universais para estudos Clem. Os 585 nanopartículas nm QD utilizados mostraram fluorescência brilhante e estável quando visto por microscopia óptica de campo amplo e foram prontamente observadas por TEM. Um estudo anterior por um dos presentes autores mostrou QDs também ser apropriado para a microscopia de luz de super-resolução 7. Sua fotoestabilidade foi particularmente útil para períodos de visionamento estendidos e exposições de im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
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