المستمر الموجة ليزر ثوليوم لتسخين الخلايا المستزرعة للتحقيق في الآثار الحرارية الخلوية
Summary
يتم تقديم الإعداد التجريبي الأصلي لخلايا التدفئة في طبق الثقافة باستخدام 1.94 ميكرون الإشعاع المستمر الموجة الليزر هنا. باستخدام هذه الطريقة، والاستجابات البيولوجية للخلايا الظهارية الصباغية الظهارية (ربي) بعد التعرض الحراري مختلفة يمكن التحقيق فيها.
Abstract
يتم عرض طريقة الأصلي لتسخين الخلايا المستزرعة باستخدام 1.94 ميكرون المستمر الموجة ليزر ثيوليوم للتقييم البيولوجي هنا. يتم امتصاص إشعاع الليزر ثوليوم بقوة عن طريق الماء، ويتم تسخين الخلايا في الجزء السفلي من طبق الثقافة من خلال نشر الحراري. يتم تعيين الألياف الليزر التي يبلغ قطرها 365 ميكرون حوالي 12 سم فوق طبق الثقافة، من دون أي البصريات، بحيث قطر شعاع الليزر يكاد يعادل تقريبا القطر الداخلي للطبق الثقافة (30 ملم). من خلال الحفاظ على كمية متسقة من وسط الثقافة في كل تجربة، فمن الممكن أن تشعي الخلايا مع زيادة درجة الحرارة استنساخه للغاية.
لمعايرة زيادة درجة الحرارة وتوزيعها في طبق ثقافة خلية واحدة لكل إعداد الطاقة، تم قياس درجة الحرارة خلال 10 ثانية من التشعيع في مواقع مختلفة وعلى المستوى الخلوي. تم تمثيل توزيع درجة الحرارة باستخدام برنامج الرسومات الرياضيةالبرنامج، ونمطه عبر طبق الثقافة كان في شكل غاوس. بعد تشعيع الليزر، يمكن إجراء تجارب بيولوجية مختلفة لتقييم استجابات الخلايا المعتمدة على درجة الحرارة. في هذه المخطوطة، يتم تقديم تلطيخ البقاء على قيد الحياة ( أي تمييز الحية، موت الخلايا المبرمج، والخلايا الميتة) للمساعدة في تحديد درجات حرارة عتبة موت الخلايا المبرمج والموت بعد نقاط مختلفة في الوقت المناسب.
مزايا هذا الأسلوب هي دقة درجة الحرارة ووقت التدفئة، فضلا عن كفاءة عالية في خلايا التدفئة في طبق ثقافة الخلية بأكملها. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح للدراسة مع مجموعة واسعة من درجات الحرارة والمدد الزمنية، والتي يمكن أن تسيطر عليها بشكل جيد من قبل نظام التشغيل المحوسب.
Introduction
فهم الاستجابات البيولوجية الخلية المعتمدة على درجة الحرارة هو من أهمية كبيرة لنجاح العلاجات هيبرثرميا. تصوير الشبكية الضوئي بالليزر مع الليزر الحراري، المستخدمة في طب العيون، هي واحدة من العلاجات الليزر الأكثر استقرارا في الطب. الضوء المرئي، ومعظمهم من الأخضر إلى الموجات الصفراء، ويستخدم في علاج الشبكية بالليزر. يتم امتصاص الضوء للغاية من قبل الميلانين في الشبكية الخلايا الصبغية الظهارية (ربي)، والتي تشكل أحادي الطبقة خلية أحادية الشبكية. كان هناك اهتمام مؤخرا بين الأطباء والباحثين في أشعة خفيفة جدا الحراري (التصوير الضوئي تحت المرئية) كاستراتيجية علاجية جديدة لأنواع مختلفة من اضطرابات الشبكية 1 ، 2 . بعد هذا الاتجاه، اهتمامنا هو في الخلايا تحت رمي التدفئة ربي تحت التحكم في درجة الحرارة دقيقة، وهي تقنية تسمى الحرارة الضوئية التي تسيطر عليها العلاج (تك-بت).
البصريات الأخيرةوقد سمح التكنولوجيا الصوتية من معهدنا لقياس الوقت الحقيقي للزيادات في درجات الحرارة في المواقع المشععة في شبكية العين. وهذا يتيح التحكم في زيادة درجة الحرارة أثناء التشعيع 3 . ومع ذلك، منذ فرط الحرارة شبه قاتلة على شبكية العين، والناجمة عن خلايا ربي التدفئة دون قاتلة، لم ينظر في السابق بسبب استحالة قياس والتحكم في درجة الحرارة، واستجابات الخلايا المعتمدة على درجة الحرارة من الخلايا ربي التالية أشعة الليزر الحرارية لديها ودرس القليل جدا حتى الآن. وعلاوة على ذلك، ليس فقط الفرق في درجة الحرارة لم تناقش بالتفصيل، ولكن أيضا الفرق في سلوك الخلية من الخلايا على قيد الحياة بعد تشعيع قاتلة وقاتلة. لذلك، لجمع الأدلة العلمية على العلاجات القائمة على تك-بت، ونحن نهدف إلى توضيح الاستجابات البيولوجية الخلية ربي تعتمد على درجة الحرارة وآلياتها باستخدام في المختبر الاجهزة التجريبية.
ل tالغرض من ذلك، فمن الضروري إنشاء الإعداد خلية التدفئة التي تلبي الشروط التالية: 1) إمكانية لزيادة درجة الحرارة بسرعة، 2) على وجه التحديد الوقت ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها، و 3) عدد كبير نسبيا من الخلايا فحصها للتجارب البيولوجية . أما بالنسبة لطريقة التسخين، فإن الليزر السريري، مثل ليزر Nd.YAG المضاعف (532 نانومتر)، لسوء الحظ غير مناسب لتدفئة ثقافة الخلايا. ويرجع هذا إلى انخفاض عدد الميلانوسومات في خلايا ربي المستزرعة. قد يكون امتصاص ضوء الليزر غير متجانسة، وتزداد درجة الحرارة على المستوى الخلوي بين التجارب، حتى عندما تشعع بنفس القدرة الإشعاعية. وقد ذكرت العديد من الدراسات السابقة استخدام ورقة سوداء تحت قاع الطبق خلال التشعيع 4 أو استخدام ميلانوسومات إضافية التي هي فاجوسيتيزد من قبل الخلايا ثقافة قبل التجارب 5 ، 6 . العديد منأجريت الدراسات البيولوجية في المختبر لتقييم استجابات الخلايا التي يسببها ارتفاع الحرارة باستخدام لوحة ساخنة، حمام ماء، أو حاضنة كو 2 مع إعداد درجة الحرارة 7 . تتطلب هذه الأساليب فترة تدفئة طويلة لأنها تستغرق بعض الوقت ( أي عدة دقائق) للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. وعلاوة على ذلك، باستخدام هذه الأساليب، فإنه من الصعب الحصول على التاريخ الحراري مفصل ( أي درجة الحرارة مضروبا في الوقت) على المستوى الخلوي. وعلاوة على ذلك، قد تختلف درجة الحرارة بين الخلايا في مواقع مختلفة في طبق ثقافة واحدة بسبب انتشار درجة الحرارة المتغيرة. في معظم الحالات، لم تؤخذ هذه المعلومات الزمنية ودرجة الحرارة المكانية أثناء ارتفاع الحرارة بعين الاعتبار للتحليلات البيولوجية، على الرغم من أن استجابة الخلايا البيولوجية قد تتأثر بشكل حاد من درجة الحرارة والمدة الزمنية لدرجة الحرارة المتزايدة.
للتغلب على هذه المشاكل، كونتيتم استخدام ليزر ثيوليوم الموجة الجديدة هنا لتسخين الخلايا. يتم امتصاص إشعاع الليزر ثوليوم (λ = 1.94 ميكرون) بقوة 8 ، ويتم تحفيز الخلايا في الجزء السفلي من طبق الثقافة حراريا فقط من خلال نشر الحراري. يتم تعيين الألياف الليزر مع قطر 365 ميكرون حوالي 12 سم فوق طبق الثقافة، من دون أي البصريات بينهما. قطر شعاع الليزر يتباعد بحيث يكاد يكون ما يعادل القطر الداخلي للطبق الثقافة (30 ملم) على سطح وسط الاستزراع.مع كمية ثابتة من الوسط الثقافي، فمن الممكن أن تشعي الخلايا مع زيادة درجة الحرارة من التكرار عالية. وتتيح إعدادات القدرة المتغيرة التشعيع بما يصل إلى 20 وات، ويمكن زيادة درجة الحرارة المتوسطة على المستوى الخلوي حتى ΔT ≈ 26 ° C في 10 ثوان.
من خلال تعديل ظروف التشعيع، فمن الممكن أيضا لتغيير شعاع الليزر الشخصي لتغيير ديستريبوتي درجة الحرارةعن، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، استنبات، ديش. على سبيل المثال، فمن الممكن التحقيق مع توزيع الحرارة مثل غاوس، كما هو الحال في الدراسة الحالية، أو مع توزيع درجة الحرارة متجانسة. هذا الأخير قد يكون مفيدا للتحقيق في آثار استجابات الخلايا المعتمدة على درجة الحرارة بشكل أكثر تحديدا للزيادات في درجة الحرارة شبه القاتلة، ولكن ليس لضغوط موت الخلايا أو استجابات التئام الجروح.
وإجمالا، يمكن أن تشعيع ثيوليوم الليزر التحقيق في أنواع مختلفة من العوامل البيولوجية، مثل التعبير الجيني / البروتين، حركية الموت الخلية، تكاثر الخلايا، وتطوير وظائف الخلية، بعد التعرض الحراري مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في مناقشة الاستجابات الخلوية البيولوجية ذات الصلة بالحرارة، ليس فقط درجة الحرارة، ولكن أيضا المدة الزمنية لدرجة الحرارة المتزايدة، من الأهمية، لأن معظم العمليات الكيميائية الحيوية تعتمد على الوقت. ولا سيما في مجال ارتفاع الحرارة الناجم عن الليزر في طب العيون، وير?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منحة بحثية من وزارة التعليم والبحث الاتحادية الألمانية (بمبف) (منحة رقم 13GW0043C) ومكتب أوروبي للبحث والتطوير في مجال الفضاء الجوي (إيوارد، ومنح # FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
