רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד
Summary
הגדרה ניסיונית מקורי לחימום תאים בצלחת תרבות באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף הקרנת לייזר מוצג כאן. באמצעות שיטה זו, התגובות הביולוגיות של פיגמנט רשתית אפיתל (RPE) תאים לאחר חשיפות תרמיות שונות ניתן לחקור.
Abstract
שיטה מקורית לחמם תאים בתרבית באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף גל tholium להערכה ביולוגית הוא הציג כאן. קרינת לייזר תוליום נקלט מאוד על ידי מים, ואת התאים בחלק התחתון של צלחת התרבות מחוממים באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי לייזר עם קוטר של 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס"מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה, כך קוטר קרן הלייזר הוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ"מ). על ידי שמירה על כמות עקבית של המדיום תרבות בכל ניסוי, אפשר להקרין את התאים עם עלייה בטמפרטורה לשחזור מאוד.
כדי לכייל את עליית הטמפרטורה ואת התפוצה שלה בצלחת אחת התא התרבות עבור כל הגדרה כוח, הטמפרטורה נמדדה במהלך 10 s של הקרנה בעמדות שונות ברמה התאית. חלוקת הטמפרטורה יוצגה באמצעות תוכנת גרפיקה מתמטיתתוכנית, ואת התבנית שלה על פני צלחת התרבות היה טופס גאוס. לאחר הקרנת לייזר, ניסויים ביולוגיים שונים יכולים להתבצע על מנת להעריך תגובות תא תלוי טמפרטורה. בכתב היד הזה, מכתים הכדאיות ( כלומר, הבחנה בין תאים חיים, אפופטוטיים, מתים) הוא הציג כדי לסייע לקבוע את טמפרטורות הסף אפופטוזיס התא ומוות לאחר נקודות שונות בזמן.
היתרונות של שיטה זו הם דיוק של הטמפרטורה ואת הזמן של חימום, כמו גם יעילות גבוהה שלה תאים חימום בתא שלם תרבות התא. יתר על כן, הוא מאפשר ללמוד עם מגוון רחב של טמפרטורות ומשך זמן, אשר יכול להיות נשלט היטב על ידי מערכת הפעלה ממוחשבת.
Introduction
הבנת התגובות הביולוגיות לתאים תלויי טמפרטורה היא בעלת חשיבות רבה לטיפולי היפרתרמיה מוצלחים. לייזר photocagulation לייזר עם לייזר תרמי, המשמשים אופתלמולוגיה, הוא אחד הטיפולים לייזר הוקמה ביותר ברפואה. אור גלוי, בעיקר מ אור ירוק אור צהוב, משמש בטיפול לייזר ברשתית. האור הוא נספג מאוד על ידי מלנין בתאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) תאים, המהווים את monolayer התא החיצוני של הרשתית. יש לאחרונה התעניינות בקרב רופאים וחוקרים בקרינה תרמית קלה מאוד (photocagulation תת גלוי) כאסטרטגיה טיפולית חדשה עבור סוגים שונים של הפרעות רשתית 1 , 2 . בעקבות מגמה זו, האינטרס שלנו הוא תת חיטה תת תאים RPE תחת בקרת טמפרטורה מדויקת, טכניקה המכונה טמפרטורה מבוקרת פוטותרמית (TC-PTT).
אופטו אחרוניםטכנולוגיה אקוסטית של המכון שלנו אפשרה את המדידה בזמן אמת של עליית הטמפרטורה באתרי מוקרן הרשתית. זה מאפשר שליטה על עליית הטמפרטורה במהלך קרינה 3 . עם זאת, מאז היפרתרמיה תת-קטלנית על הרשתית, הנגרמת על ידי חימום תאים RPE תת תת קטלני, לא נחשב בעבר בשל חוסר האפשרות של מדידה ושליטה על הטמפרטורה, תגובות תא תלוי טמפרטורה של תאים RPE בעקבות הקרנה בלייזר תרמי יש נחקרו מעט מאוד עד כה. יתר על כן, לא רק ההבדל הטמפרטורה לא נדונו בפירוט, אלא גם את ההבדל בהתנהגות התא של תאים ששרדו לאחר הקרנה תת קטלני קטלני. לכן, כדי לאסוף ראיות מדעיות על TC-PTT מבוססי טיפולים, אנו שואפים להבהיר את התאים תלויי הטמפרטורה תא RPE התא והמנגנונים שלהם באמצעות setups ניסיוני חוץ גופית .
עבור tמטרתו, יש צורך להקים התא חימום המערכת העומדת בתנאים הבאים: 1) אפשרות להגדלת הטמפרטורה מהר, 2) זמן מבוקרים מדויק טמפרטורה, 3) מספר גבוה יחסית של תאים שנבדקו עבור ניסויים ביולוגיים . לגבי שיטת החימום, לייזר קליני, כגון תדר Nd.YAG הכפול תדר (532 ננומטר), הוא למרבה הצער לא מתאים לתא התרבות התא. הסיבה לכך היא מספר מופחת של מלנוזומים בתאי RPE תרבותי. הקליטה של אור הלייזר עשויה להיות בלתי-הומוגנית, ועליית הטמפרטורה ברמת הסלולר משתנה בין ניסויים, גם כאשר מוקרנת עם אותה עוצמת קרינה. מספר מחקרים קודמים דיווחו על שימוש בנייר שחור מתחת לתחתית התבשיל במהלך הקרנה 4 או שימוש במלנוזומים נוספים, כי הם phagocytized על ידי תאים התרבות לפני הניסויים 5 , 6 . הרבה מבמבחנה ביולוגית מחקרים להערכת תגובות התא המושרה היפרתרמיה בוצעו באמצעות צלחת חמה, אמבט מים, או CO 2 חממה עם הגדרת טמפרטורה 7 . שיטות אלה דורשות תקופת חימום ארוכה כי זה לוקח קצת זמן ( כלומר, כמה דקות) כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה. יתר על כן, בשיטות אלה, קשה להשיג היסטוריה תרמית מפורט ( כלומר, טמפרטורה כפול זמן) ברמה התאית. יתר על כן, הטמפרטורה בין התאים בעמדות שונות בצלחת תרבות אחת עשויים להשתנות בשל דיפוזיה טמפרטורה משתנה. ברוב המקרים, מידע טמפרטורתי וזמני מרחבי זה במהלך היפרתרמיה לא נלקח בחשבון לצורך ניתוחים ביולוגיים, למרות שתגובת התא הביולוגי עלולה להיות מושפעת בצורה קריטית מהטמפרטורה ומהמשך הזמן של הטמפרטורה המוגברת.
כדי להתגבר על בעיות אלה, contiהלייזר גל thulium נוזל שימש כאן כדי לחמם את התאים. קרינת לייזר תוליום (λ = 1.94 מיקרומטר) הוא נספג מאוד על ידי מים 8 , ואת התאים בחלק התחתון של צלחת תרבות הם מגורה תרמית אך ורק באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי הלייזר עם קוטר 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס"מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה בין לבין. קוטר קרן הלייזר מפריד כזה שהוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ"מ) על פני השטח של המדיום תרבות.עם כמות עקבית של המדיום תרבות, אפשר להקרין את התאים עם עליית הטמפרטורה של הדירות גבוהה. הגדרות כוח משתנה מאפשרות הקרנה עם עד 20 ואט, והטמפרטורה בינונית ברמה התאית יכולה להיות מוגברת עד ΔT ≈ 26 ° C ב 10 שניות.
על ידי שינוי תנאי הקרנה, ניתן גם לשנות את פרופיל קרן הלייזר כדי לשנות את הטמפרטורה distributiעל בצלחת תרבותית. לדוגמה, ניתן לחקור עם הפצה טמפרטורה כמו גאוס, כמו במחקר הנוכחי, או עם חלוקת טמפרטורה הומוגנית. זה האחרון עשוי להיות מועיל לחקר ההשפעות של התגובות הטמפרטורה תלויי תא יותר ספציפי עבור טמפרטורות קטלניות מתחת לטמפרטורות, אבל לא ללחץ מוות של תאים או תגובות ריפוי הפצע.
בסך הכל, קרינה לייזר תוליום עשוי לאפשר את החקירה של סוגים שונים של גורמים ביולוגיים, כגון ביטוי גנים / חלבון, קינטיקה מוות של תאים, התפשטות תאים, ופיתוח פונקציונליות התא, לאחר חשיפות תרמיות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתייחסות לתגובות תאולוגיות ביולוגיות הקשורות לטמפרטורה, לא רק הטמפרטורה, אלא גם משך הזמן של הטמפרטורה המוגברת, היא בעלת חשיבות, שכן רוב התהליכים הביוכימיים תלויים בזמן. במיוחד בתחום של היפרתרמיה המושרה בלייזר ברפואת עיניים, בשל טווח הזמן הקצר – בין אלפיות השנייה לש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (BMBF) (מענק # 13GW0043C) וכן משרד אירופי של מחקר ופיתוח חלל (EOARD, מענק # FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
