उल्टे कोलाइडयन क्रिस्टल पाली (ethylene glycol) पाड़ के निर्माण: जिगर ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक तीन आयामी सेल संस्कृति मंच
Summary
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Abstract
, Xenobiotics 'cytotoxicity के परीक्षण के वायरस के संक्रमण का अध्ययन और जिगर पर लक्षित दवाओं को विकसित करने के उद्देश्य के लिए इन विट्रो में hepatocyte समारोह को बनाए रखने की क्षमता है, एक मंच है जो कोशिकाओं में उचित जैव रासायनिक और यांत्रिक संकेतों प्राप्त की आवश्यकता है। हाल जिगर ऊतक इंजीनियरिंग सिस्टम कृत्रिम या प्राकृतिक हाइड्रोजेल से बना तीन आयामी (3 डी) scaffolds कार्यरत है, उनके उच्च पानी प्रतिधारण और कोशिकाओं द्वारा की जरूरत यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रदान करने की क्षमता को देखते हुए। वहाँ उल्टे कोलाइडयन क्रिस्टल (आईसीसी) पाड़ में बढ़ती रुचि रही है, हाल ही में एक विकास है, जो उच्च स्थानिक संगठन, homotypic और heterotypic सेल बातचीत, साथ ही सेल-बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) बातचीत की अनुमति देता है। इस के साथ साथ, हम पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) diacrylate (PEGDA) और कण लीचिंग विधि का उपयोग आईसीसी पाड़ निर्माण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। संक्षेप में, एक जाली microsphere कणों से बना है, जो एक पूर्व polyme के बादआर समाधान जोड़ा जाता है, ठीक से polymerized, और कणों तो हटा रहे हैं, या leached, एक कार्बनिक विलायक (जैसे, tetrahydrofuran) का उपयोग। नियंत्रित ताकना आकार और interconnectivities है कि मीडिया और अधिक आसानी से कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के साथ एक बेहद असुरक्षित पाड़ में जाली परिणाम के विघटन। इस अनूठी संरचना कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से pores के बीच आसानी से संचार, और कोट करने की क्षमता प्रोटीन के साथ PEGDA आईसीसी पाड़ भी सेल के प्रदर्शन पर एक उल्लेखनीय प्रभाव को दर्शाता है का पालन करने के लिए उच्च सतह क्षेत्र की अनुमति देता है। हम व्यवहार्यता के संदर्भ में पाड़ की आकृति विज्ञान के साथ ही हिपेटोकार्सिनोमा सेल (हं-7.5) व्यवहार का विश्लेषण और आईसीसी संरचना और ईसीएम कोटिंग्स के प्रभाव का पता लगाने के लिए कार्य करते हैं। कुल मिलाकर, इस पत्र में एक उभरती हुई पाड़ कि ऊतक इंजीनियरिंग में विस्तृत आवेदन पत्र, विशेष रूप से जिगर ऊतक इंजीनियरिंग की है की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Introduction
जिगर कार्यों की एक भीड़, खून की विषहरण, xenobiotics की चयापचय, और सीरम प्रोटीन के उत्पादन सहित के साथ एक उच्च vascularized अंग है। जिगर ऊतक अनेक प्रकार की कोशिकाओं, पित्त canaliculi, sinusoids, और विभिन्न biomatrix संरचना और विभिन्न ऑक्सीजन सांद्रता के क्षेत्रों के शामिल है, एक जटिल तीन आयामी (3 डी) microstructure है। इस विस्तृत संरचना को देखते हुए यह मुश्किल हो गया है इन विट्रो 1 में एक उचित जिगर मॉडल बनाने के लिए। हालांकि, वहाँ इन विट्रो मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण दवा विषाक्तता 2 के लिए प्लेटफॉर्म के रूप में मानव hepatocytes होस्टिंग और जिगर 3 के साथ जुड़े रोगों के अध्ययन के लिए एक बढ़ती मांग है।
वर्तमान जिगर ऊतक इंजीनियरिंग प्लेटफॉर्म एक अलग-थलग, या Zona की, जैव रासायनिक संरचना में कुछ पर ध्यान केंद्रित कर, जिगर के मापदंडों के, 4 कोशिकाओं का अर्थात् सह संस्कृति से जिगर की जटिलता को सरल बना दियाएल microenvironments 5, प्रवाह की गतिशीलता 6,7 और 8 biomatrix के विन्यास। biomatrix का विन्यास ऐसी पाड़ सामग्री, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन की संरचना, मैट्रिक्स कठोरता के रूप में अच्छी तरह से डिजाइन और पाड़ की संरचना के रूप में मानकों में तोड़ा जा सकता है। वहाँ सिंथेटिक हाइड्रोजेल, विशेष रूप से पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) 9 हाइड्रोजेल का उपयोग ऊतक इंजीनियरिंग की पढ़ाई में वृद्धि की गई है, धुन हाइड्रोजेल के यांत्रिक गुणों, bioactivity, और गिरावट की दर की क्षमता दी। जिगर से संबंधित अनुसंधान के बारे में, biocompatible हाइड्रोजेल जिगर की बीमारी के 3 वायरस के संक्रमण के अध्ययन के लिए लागू किया गया था। एक hepatocyte मंच डिजाइन के रूप में, कई अध्ययनों 3 डी वातावरण और सेल ईसीएम और सेल सेल बातचीत जो विवो microenvironment में नकल करने के लिए आवश्यक हैं प्रदान करने के लिए एक हाइड्रोजेल 12,13 भीतर hepatocyte सैंडविच संस्कृतियों 10,11 और सेल encapsulation उपयोग किया है। होवेदेखें, इन प्लेटफार्मों नियंत्रण और स्थानिक संगठन के एक उच्च डिग्री के पास नहीं है, पाड़ 14 के माध्यम से गैर वर्दी गुण के लिए अग्रणी।
उल्टे क्रिस्टल कोलाइडयन (आईसीसी) 14 पाड़ सेल संस्कृति है कि पहली बार 2000 के दशक में शुरू किया गया था के लिए एक उच्च स्तरीय आयोजन 3 डी पाड़ है। पाड़ की अनोखी संरचना सरल निर्माण की प्रक्रिया एक कोलाइडयन क्रिस्टल, चर व्यास के कोलाइडयन कण के एक आदेश जाली का उपयोग करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। संक्षेप में, इस प्रक्रिया को संक्षेप में प्रस्तुत करने, कण बड़े करीने से व्यवस्था और गर्मी का उपयोग कर एक जाली फार्म annealed रहे हैं। इस जाली के leaching, एक कार्बनिक विलायक से, उच्च सतह क्षेत्र के साथ hexagonally पैक गोलाकार गुहाओं 15 में एक polymerized हाइड्रोजेल परिणामों में। यह बेहद आदेश दिया पाड़ पहले दोनों कृत्रिम और प्राकृतिक सामग्री के साथ बनाया गया है, लेकिन सहित नहीं (एक्रिलामाइड) 16-21, पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) 15,22-30 पाली तक सीमित, पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) 31,32, पाली (2-hydroxyethyl methacrylate) 21,33-35, और chitosan 36-39। आईसीसी गैर-दूषण सामग्री के बने मचान गुहाओं 14,23,40 भीतर सेलुलर spheroids को बढ़ावा देने के लिए करते हैं। अनेक प्रकार की कोशिकाओं को सफलतापूर्वक पैदा करने के लिए इस विन्यास के भीतर अंतर और समारोह, chondrocytes 41, अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं 42 सहित, और स्टेम कोशिकाओं 43,44 दिखाया गया है। Hepatocyte के बारे में, पढ़ाई के ना 2 SiO 3 और पाली (एक्रिलामाइड) के बने आईसीसी scaffolds, लेकिन नहीं खूंटी के साथ आयोजित किया गया है। सरल bioconjugation रणनीति के साथ (यानी, ईडीसी / एन एच एस के माध्यम से अमाइन युग्मन), ईसीएम प्रोटीन संयुग्मित खूंटी-आधारित scaffolds, गढ़े जा सकता है कि और अधिक सेल बाध्यकारी साइटों साबित हो सकता है पर्यावरण की तरह विवो में एक और अधिक हो सकता है और यकृत समारोह में वृद्धि करने के लिए।
इस पांडुलिपि और जुड़े वीडियो में, विस्तार आईसीसी पाड़ के निर्माण हमपाली (एथिलीन ग्लाइकोल) diacrylate (PEGDA) हाइड्रोजेल और एक polystyrene microsphere जाली, हिपेटोकार्सिनोमा के लिए अनुकूलित (ना-7.5) संस्कृति का उपयोग कर। हम पाड़ टोपोलॉजी और सेल प्रदर्शन के मामले में आम तौर पर nonadhesive नंगे PEGDA आईसीसी scaffolds और कोलेजन लेपित PEGDA आईसीसी पाड़ के बीच मतभेदों को प्रदर्शित करता है। सेल व्यवहार्यता और समारोह हं-7.5 सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक मापा जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds तेजी से सभी शारीरिक और जैव रासायनिक, पुनर्जन्म को बनाए रखने, या अंग प्रतिस्थापन के आवेदन के लिए ऊतकों की मरम्मत, बीमारी का अध्ययन दवाओं के विकास के लिए आवश्यक संकेत, और कई अन्य लोगों …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को एक राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन फैलोशिप (एनआरएफ -NRFF2011-01) और प्रतिस्पर्धी अनुसंधान कार्यक्रम (एनआरएफ-CRP10-2012-07) से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
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