肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製
Summary
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Abstract
インビトロでの肝細胞の機能を維持する能力は 、生体異物「細胞毒性を試験ウイルス感染を研究し、肝臓での標的薬の開発のために、細胞は、適切な生化学的および機械的な合図を受信するプラットフォームを必要とします。最近の肝組織工学システムは、その高い保水性、細胞によって必要とされる機械的な刺激を提供する能力を与えられた、合成または天然のハイドロゲルからなる三次元（3D）スキャフォールドを採用しています。反転コロイド結晶（ICC）足場、高い空間組織、同型および異細胞の相互作用、ならびに細胞外マトリックス（ECM）の相互作用を可能にする最近の開発、への関心が高まってきました。ここで、我々は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）と粒子浸出法を用いてICC足場を製造するためのプロトコルを説明します。簡潔には、格子は、後のプリpolyme微小球粒子から形成されていますRの溶液は適切に重合し、添加し、次いで、粒子を有機溶媒（ 例えば、テトラヒドロフラン）を使用して、除去し、または浸出されます。メディアをより簡単に細胞に到達することを可能にする制御された細孔サイズとinterconnectivitiesを有する高度に多孔質足場の格子結果の解散。このユニークな構造は、細胞が同様に簡単に毛穴の間の通信、およびタンパク質とPEGDAのICC足場はまた、電池性能に顕著な効果を示してコートする能力のことを遵守するための高い表面積を可能にします。私たちは、生存能力の点で足場の形態と同様に肝細胞癌細胞（ホ-7.5）行動を分析し、ICCの構造およびECMコーティングの効果を調査するために機能します。全体的に、この論文は、組織工学における幅広い用途を持つ新興足場、特に肝組織工学の詳細なプロトコルを提供します。
Introduction
肝臓は、血液の解毒、生体異物の代謝、および血清タンパク質の産生を含む多数の機能を有する高度に血管器官です。肝臓組織は、複数の細胞型、毛細胆管、正弦波、及び異なるバイオマトリックス組成物と異なる酸素濃度のゾーンを含む、複雑な3次元（3D）微細構造を有します。この精巧な構造を考えると、 インビトロ 1 における適切な肝臓モデルを作成することは困難でした。しかし、薬物毒性2をテストし、肝臓3に関連する疾患を研究するためのプラットフォームとして、ヒト肝細胞をホスティングしているin vitroモデルにおける機能の需要があります。
現在の肝臓組織工学プラットフォームは、肝臓のパラメータ、セル4の、すなわち共培養、透明帯の生化学的組成の、1を単離し、または数に着目して、肝臓の複雑さを単純化していますリットルの微小環境5、流体力学6,7およびバイオマトリックス8の構成。バイオマトリックスの構成は、このような足場材料、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の組成は、マトリックス剛性だけでなく、足場の設計や構造などのパラメータに分けることができます。曲ヒドロゲルの機械的性質、生物活性、および分解速度の能力を考えると、合成ヒドロゲル、特にポリ（エチレングリコール）（PEG）9ヒドロゲルを用いた組織工学研究の上昇がありました。肝臓に関連する研究については、生体適合性ヒドロゲルは、肝疾患3のウイルス感染の研究のために適用しました。肝細胞プラットフォームの設計としては、多くの研究は、in vivo微小環境に模倣するために必須である3D環境および細胞- ECMおよび細胞-細胞相互作用を提供するために、ヒドロゲル12,13内の肝細胞サンドイッチ培養10,11及びセルカプセル化を利用してきました。ハウ版、これらのプラットフォームは、足場14を介して不均一な特性につながる、制御および空間的構成の高度を持っていません。
反転結晶コロイド（ICC）は14足場は、最初の2000年代初頭に導入された細胞培養のための高度に組織化された3次元の足場です。足場のユニークな構造は、コロイド結晶、可変直径のコロイド粒子の規則正しい格子を使用した簡単な製造プロセスに起因し得ます。簡潔には、プロセスを要約するために、粒子が整然と配置され、格子を形成するために熱を使用してアニールされます。高表面積をもつ六角形パックされた球状の空洞15中の重合ヒドロゲル結果の有機溶剤によって、この格子の浸出、、。この高度に秩序足場は、以前含む、合成および天然両方の材料で作られたが、ポリ（アクリルアミド）、16-21に限定されるものではなく、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、15,22-30されています、ポリ（エチレングリコール）31,32、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、21,33-35、およびキトサン36-39。非ファウリングの素材で作られたICC足場は、空洞14,23,40内の細胞スフェロイドを促進する傾向があります。複数の細胞型は、骨髄間質細胞が42、軟骨細胞41を含め、正常にこの構成の中に、増殖分化および機能することが示され、細胞43,44幹されています。肝細胞について、研究がICC用のNa 2にSiO 3及びポリ（アクリルアミド）からなる骨格ではなく、PEGを用いて実施されてきました。単純なバイオコンジュゲーション戦略を有する（ すなわち 、EDC / NHSを介して、アミンカップリング）、ECMタンパク質共役PEGベースの足場が環境など、in vivoでの詳細あると肝機能を向上させるために多くの細胞結合部位を証明することができ、製造することができます。
この原稿と関連するビデオでは、我々の詳細ICC足場の製作肝細胞癌（ホ-7.5）の培養のために最適化されたポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）ヒドロゲル、ポリスチレン微小球格子を使用。私たちは、足場のトポロジと電池性能の点で、一般的に非粘着性の裸のPEGDAのICC足場とコラーゲンコーティングPEGDAのICC足場との違いを示しています。細胞の生存および機能ホ-7.5細胞の挙動を評価するために、定性的および定量的に測定されます。
Protocol
1. ICCの足場の作製（図1） ポリスチレン（PS）格子（;ビーズの8-13層直径= 6 mm）を準備します。 金型を製造するために、40μlのレベルで0.2ミリリットル沸騰プルーフマイクロ遠心チューブからヒントを遮断します。防水接着剤で24×60 mm 2の顕微鏡カバーガラススリップにカットチューブの上部を接着。 慎重に水懸濁液をピペット、およびバイアルに70％エタノール?…
Representative Results
ICC足場の構造的特徴と肝細胞を培養することで、各ICC足場条件の有効性を比較するための代表的な結果が示され、以下に説明されています。これらの結果に使用されるICC足場条件は、0μgの/ mlの（ベア）のコラーゲンコーティングを20μg/ mlの（コラーゲン20）を200μg/ mlの（コラーゲン200）、及び400μgの/ mlの（コラーゲン400）と初期あります許-7.5細胞播種数は1×10 …
Discussion
組織工学足場は急速にすべての、再生、維持、または薬物を、疾患を研究開発、臓器置換の適用のための組織を修復するために必要な物理的および生化学的手がかり、および他の多くの57を提供するように進化しています。肝組織工学では、初代ヒト肝細胞は急速にエンジニアリング足場と肝機能を維持するための開発プラットフォームのための大きい必要性を作成し、一度本体から…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、国立研究財団フェローシップ（NRF -NRFF2011-01）と競争的研究計画（NRF-CRP10-2012-07）からの支援を承認したいと思います。
Materials
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
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Cite This Article
Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).